周欣欣，張曉宇，周 輝，王小妹

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000; 2.湖南省第二人民醫(yī)院 手足外科，湖南 長沙 410000)

不可分型流感嗜血桿菌(Nontypeable haemophilus influenzae，NTHi)為革蘭陰性桿菌,無莢膜，常寄居于人類上呼吸道，是重要的機會致病菌，能引起肺炎等炎癥反應[1]。研究表明[2]，NTHi 在感染呼吸道過程中主要通過釋放內(nèi)毒素、以及蛋白水解酶等毒性產(chǎn)物，促進呼吸道粘膜炎癥因子釋放進而導致組織炎癥反應。而過度的呼吸道炎癥反應將進一步誘導慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生[3]，因此有效預防NTHi感染所致的炎癥反應在臨床COPD的防治應用中具有重要意義。

多種調(diào)控機制參與NTHi在感染呼吸道上皮細胞誘導炎癥反應的過程。已有研究證實，NTHi感染肺泡上皮細胞株，能夠激活p38 MAPK信號通路進而誘導炎癥反應的發(fā)生[4]。此外，NTHi同樣也可以通過ERK MAPK信號通路來上調(diào)肺泡上皮細胞株A549炎癥因子IL-8的分泌[5]。盡管如此，但到目前為止我們?nèi)圆磺宄﨨THi具體的致炎機制。因此，本研究將以NF-κB信號通路為切入點，明確NTHi誘導人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B產(chǎn)生炎癥因子的分子機制，進而為預防及治療NTHi感染相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 不可分型流感嗜血桿菌菌株(ATCC-49247)采購自美國ATCC公司；人正常支氣管上皮細胞(BEAS-2B)采購于中科院細胞庫；Human IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自Invitrogen公司；TLR2干擾RNA購自InvivoGen公司；MyD88抑制劑NBP2-29328購自Sigma公司；NF-κB抑制劑(BAY11-7082)購自Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；IκB、β-actin抗體采購于Cell Signaling Technology公司； PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 細胞處理 將新配置的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)加入BEAS-2B細胞中，并將細胞至于37 ℃、5 % CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，重新處理細胞并放至6孔板中培養(yǎng)，進行如下處理：以MOI=1、5、10的NTHi感染細胞24 h，并收集細胞及細胞上清液于-20 ℃保存待用。

1.3 ELISA檢測 按照IL-6、IL-1βELISA檢測試劑盒說明書的要求，對上述處理后的細胞上清中細胞因子的水平進行檢測。檢測完成后，用酶標儀對各組細胞樣本的OD值進行測定(450 nm)，每種實驗重復3次。采用試劑盒中標準品的檢測結(jié)果繪制標準曲線，進而對各細胞上清液中IL-6、IL-1β的表達水平進行計算。

1.4 定量PCR檢測 按照Trizol試劑盒說明書步驟，提取上述收集細胞的總RNA，進行純化后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)，隨后按照RT-PCR反應體系進行引物擴增。反應條件為：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。引物設(shè)計如下：IL-1βF：TGGCAATGAGGATGACTTGT；R： TGGTGGTCGGAG-ATTCGTA。IL-6 F：TACATCCTCGACGGCATCTC；R： TTTCAGCCATCTTTGGAAGG。TLR2 F：GCTCCTGCGAACTCCTATCC；R： CAAAGAGACTCCAGACACCAG。MyD88 F：CCGCCTGTCTCTGTTCTTG；R： GTCGCTTGTGTCTCCAGTT。擴增完畢后，使用2-△Ct法計算IL-1β、IL-6、以MyD88及TLR2 mRNA相對的表達量。

1.5 RNA干擾 RNA干擾實驗采用非特異性特異性TLR2靶向siRNA(InvivoGen)和siRNA(siRNA control，NWG Biotech)。參照Nucleofector試劑盒說明書操作：取2 μg(約25 nmol/L)siRNA轉(zhuǎn)染到106個BEAS-2B細胞中，培養(yǎng)48 h后，再繼續(xù)用NTHi處理24 h，隨后收集細胞及上清用于后續(xù)實驗。

1.6 Western blot檢測 收集處理后的細胞，在細胞中加入150 μL細胞裂解液，反復吹打均勻，1 500 rpm離心10 min后收集上清。隨后取10 μL蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，并于轉(zhuǎn)膜儀中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后4℃封閉過夜，隨后分別用稀釋好的一抗和二抗進行孵育并進行ECL發(fā)光顯影(顯影儀中)。

2 結(jié)果

2.1 NTHi誘導BEAS-2B細胞分泌IL-1β和IL-6 為了明確NTHi對BEAS-2B細胞分泌促炎因子的影響，NTHi刺激后ELISA檢測細胞上清炎癥因子水平。結(jié)果顯示用MOI=1、5、10的NTHi感染BEAS-2B細胞24h后，細胞上清中IL-1β和IL-6顯著增高，且呈濃度依賴性(見圖1)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖1 NTHi刺激BEAS-2B細胞分泌IL-1β以及IL-6

2.2 NTHi誘導BEAS-2B細胞表達IL-1β和IL-6 mRNA 進一步采用qRT-PCR對BEAS-2B細胞中IL-1β和IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果一致，MOI=1、5、10的NTHi感染BEAS-2B細胞24 h時，隨著NTHi濃度的增高，IL-1β和IL-6 mRNA的表達量顯著增高(見圖2)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖2 NTHi誘導BEAS-2B細胞IL-1β以及IL-6 mRNA表達

2.3 抑制NF-κB信號通路下調(diào)NTHi誘導IL-1β和IL-6分泌 Western blot結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞后，細胞內(nèi)IκB的磷酸化水平(p-IκB)較未感染組顯著上升(見圖3A)。而進一步采用10μMNF-κB抑制劑BAY11-7082預處理后NTHi感染細胞，結(jié)果顯示細胞內(nèi)IL-1β和IL-6水平顯著減少(見圖3B)。

*：與MOI=0相比， P<0.05；#：與MOI=10，BAY11-7082(—)相比，P<0.05。圖3 NTHi激活NF-κB信號通路誘導BEAS-2B細胞分泌IL-1β以及IL-6

2.4 NTHi感染BEAS-2B細胞激活TLR2以及MyD88 為了明確TLR2以及MyD88在NTHi誘導IL-1β和IL-6分泌中的作用。NTHi感染BEAS-2B細胞后，我們采用RT-PCR檢測細胞內(nèi)TLR2以及MyD88的活化情況。結(jié)果顯示，NTHi刺激后細胞內(nèi)TLR2以及MyD88的表達水平均要顯著高于未感染對照組(見圖4)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖4 NTHi感染BEAS-2B細胞活化TLR2以及MyD88

2.5 沉默TLR2/ MyD88下調(diào)IL-1β和IL-6分泌 進一步采用siRNA以及MyD88抑制劑處理細胞，并檢測細胞上清IL-1β和IL-6的分泌水平。結(jié)果顯示，siRNA沉默TLR2后，BEAS-2B細胞中IL-1β和IL-6分泌水平較未沉默的對照組顯著降低(見圖5)。此外，采用MyD88抑制劑處理后細胞中IL-1β和IL-6的分泌水平也顯著降低(見圖6)。

*：與MOI=0，siRNA(—)相比， P<0.05；#：與MOI=10，siRNA(—)相比， P<0.05。圖5 抑制TLR2下調(diào)IL-1β和IL-6表達

*：與MOI=0，inhibitor(—)相比，P<0.05；#：與MOI=10，inhibitor(—)相比，P<0.05。圖6 抑制MyD88下調(diào)IL-1β和IL-6表達

3 討論

NTHi是常寄生于上呼吸道的條件致病菌，是引起COPD加重的主要因素[3]。目前體內(nèi)外實驗已經(jīng)證實[6]，NTHi可誘導呼吸道上皮細胞分泌IL-1β、IL-8、TNF-α、ICAM-1等多種促炎細胞因子以及趨化因子，進而介導NTHi感染后的炎癥反應。然而到目前為止，關(guān)于NTHi誘導呼吸道炎癥反應的具體分子機制仍未明了[7]。所以，探究NTHi的致炎機制對于開發(fā)設(shè)計相關(guān)的治療藥物至關(guān)重要。

炎癥反應是NTHi致病的重要環(huán)節(jié)，NTHi感染呼吸道上皮細胞后分泌趨化因子以及炎癥因子是導致呼吸道以及肺組織病理損傷的一個關(guān)鍵因素[8]。過度的炎癥反應還可以導致細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，進而誘發(fā)組織病理損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)[9]，NTHi或能夠誘導呼吸道細胞分泌炎癥因子IL-8。而本研究中，NTHi感染支氣管上皮BEAS-2B細胞后，能夠明顯誘導炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。由于IL-1β是機體調(diào)節(jié)炎癥反應的重要介質(zhì)，能促進其它促炎細胞因子的產(chǎn)生及分泌[8]。而IL-6是一種促炎細胞因子，則能夠直接參與機體的炎癥反應，與組織炎性損傷密切相關(guān)[10]。因此，我們的結(jié)論與之前的研究相符。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其能夠?qū)⑼饨绲拇碳ば盘栍行鲗е良毎麅?nèi)，在免疫反應、炎癥反應、細胞分化以及正常細胞和惡性細胞的存活中發(fā)揮重要作用[11]。此外，NF-κB活化后還可通過調(diào)節(jié)固有免疫應答參與機體組織的炎癥反應。已有研究證實[12]，NTHi可通過活化宿主細胞NF-κB信號通路，誘導產(chǎn)生IL-8。而本研究結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞后可明顯誘導細胞內(nèi)IκB的磷酸化水平，提示NF-κB信號通路被激活。而進一步采用NF-κB抑制劑BAY11-7082預處理細胞，細胞內(nèi)IL-1β和IL-6的表達水平均顯著降低，證實NF-κB也參與了NTHi誘導的IL-1β和IL-6分泌。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一種非常重要的天然免疫(非特異性免疫)識別受體，它能夠有效連接非特異性免疫和特異性免疫,參與多種細胞、組織、疾病的發(fā)生發(fā)展[13-16]。TLR2可以有效識別革蘭陰性菌的脂多糖，通過活化細胞內(nèi)的多條信號通路，進而誘導炎癥反應的發(fā)生[17]。有研究表明[18-19]，TLR2能夠參與多種呼吸道病原體誘導的炎癥反應，其中就包括衣原體，肺炎支原體等；在本次研究中，siRNA沉默TLR2后能夠明顯抑制 IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，說明TLR2通路可能參與了NTHi對炎癥反應的誘導作用。MyD88是TLRs信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。課題組進一步采用MyD88抑制劑對細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)NTHi誘導IL-1β和IL-6分泌也同樣受到抑制。

綜上所述，本研究證實NTHi能夠誘導支氣管上皮BEAS-2B細胞分泌IL-1β和IL-6，且該機制或與TLR2/ MyD88及NF-κB信號通路的活化相關(guān)聯(lián)。但TLR2/ MyD88以及NF-κB信號通路活化后的作用機制目前尚未明了，有待進一步探討。本研究為闡明NTHi的致炎機制及臨床防治、治療NTHi感染提供了實驗基礎(chǔ)。