黃志深，許喜林，張明明，肖劍，雷燕

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

副溶血性弧菌是引起水產(chǎn)品食源性疾病的主要致病菌。我國(guó)海岸線較長(zhǎng)，且沿海城鎮(zhèn)往往是人員居住密集的地方，水產(chǎn)品是沿海居民鐘愛(ài)的食品，居民不慎食用受到副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品造成集體食物中毒是沿海人民細(xì)菌性食物中毒主要原因，而副溶血性弧菌食物中毒通常表現(xiàn)為出現(xiàn)中毒癥狀人數(shù)多，但較少死亡。金連梅等[1]對(duì)2004年至2007年全國(guó)食物中毒事件分析，及何潔儀等[2]對(duì)1997年至2007年廣州市發(fā)生的副溶血性弧菌食物中毒事件和中毒樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均表明副溶血性弧菌在各食源性致病菌食物中毒事件中居首位，故對(duì)水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌的毒力及藥敏性研究具有重要意義。

在副溶血性弧菌致病因子的研究方面，耐熱性直接溶血毒素（TDH）、耐熱性相關(guān)溶血毒素（TRH）、不耐熱溶血毒素（TLH）是副溶血性弧菌的主要溶血毒素。耐熱直接毒素TDH是Obara在KP試驗(yàn)（神奈川試驗(yàn)）呈現(xiàn)陽(yáng)性的副溶血性弧菌液體培養(yǎng)基中分離得到的，化學(xué)成分主要為無(wú)糖、脂質(zhì)的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為42000 u，該毒素在100 ℃仍能保持10 min活性，屬耐高溫毒素，所以稱為 TDH[3]。Nishibuchi等在食物中毒病例中分離出一批副溶血性弧菌為KP試驗(yàn)呈現(xiàn)陰性，但不產(chǎn)生TDH，認(rèn)為除TDH外，副溶血性弧菌還有其他致病因子，研究發(fā)現(xiàn)這種因子同樣可導(dǎo)致溶血現(xiàn)象、細(xì)胞致死現(xiàn)象、引起腸毒性、心臟毒性等與TDH相似的癥狀，但相比TDH，其在100 ℃10 min不能存活，呈現(xiàn)不耐熱，且溶解牛紅細(xì)胞、不溶解馬紅細(xì)胞，與 TDH引起溶血作用的敏感動(dòng)物紅細(xì)胞種類不同，分子質(zhì)量為48000 u，與KP陽(yáng)性無(wú)關(guān)，命名為 TRH[4]。TLH[5]需要卵磷脂的存在才具有溶血活性，由兩種具有交叉免疫原性，分子質(zhì)量為43000 u和45000 u的蛋白質(zhì)組成，能溶解人和馬的紅細(xì)胞，是一種非典型的磷脂酶。而在副溶血性弧菌脲酶生化研究方面，有研究表明副溶血性弧菌脲酶陽(yáng)性與致病性有相關(guān)性，脲酶陽(yáng)性菌株能引起小鼠腹瀉。也有發(fā)現(xiàn)表明副溶血性弧菌的脲酶與人的感染聯(lián)系不大，但有試驗(yàn)表明脲酶陽(yáng)性菌株與trh之間呈正相關(guān)[3,4]。

在副溶血性弧菌毒力基因攜帶情況的研究方面，對(duì)副溶血性弧菌的毒力基因，認(rèn)識(shí)比較清楚的是溶血素基因，包括編碼TDH的基因tdh，編碼TRH的基因trh，以及編碼TLH的基因tlh。研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因（type three secretion system，TTSS）及tdh毒力基因等組成一個(gè) 80 kb的毒力島。trh基因分為trh1和trh2兩種，研究發(fā)現(xiàn)鎳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)操縱子、尿素酶基因簇及trh基因是緊密相連在染色體上，故檢測(cè)尿素酶活性可判斷該副溶血性弧菌菌株是否trh陽(yáng)性[6]。陳偉偉等對(duì)1998年以來(lái)從福建省分離的48株副溶血性弧菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，其中包括食物中毒臨床病人樣品中分離的21株，食品樣品分離的27株，結(jié)果為食品和臨床病人分離菌株均檢出tlh基因，未檢出trh基因；臨床患者分離的21株均檢出tdh基因，而食品分離的27株中tdh基因檢出率為37.00%，表明副溶血性弧菌食物中毒與副溶血性弧菌的tdh基因有關(guān)，tdh基因可作為副溶血性弧菌致病性的特異性檢測(cè)項(xiàng)目[7]。ToxR/S是大流行株相關(guān)毒力基因，大流行株指的是可在較短時(shí)間內(nèi)在較大范圍引起公共衛(wèi)生事件的菌株。toxR/S是膜整合蛋白，在弧菌毒力基因轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)中發(fā)揮重要作用，廣泛存在于副溶血性弧菌無(wú)毒力和毒力菌株中[8]。

在副溶血性弧菌對(duì)抗菌類藥物敏感性的研究方面，其結(jié)果在不同菌株間常表現(xiàn)一定差異。通常表現(xiàn)對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢噻肟、磺胺等藥物敏感，對(duì)頭孢唑啉、呋喃唑酮、紅霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、氨芐西林等耐藥。朱敏等對(duì)來(lái)自門(mén)診腹瀉患者、肉類食品、食物中毒患者等不同來(lái)源的120株副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明頭孢呋辛酯、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻吩的耐藥率均在50.00%以上，對(duì)氨芐西林耐藥率為49.17%、羧芐西林耐藥率為 43.33%、阿莫西林/克拉維酸耐藥率為32.50%，對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、慶大霉素、米若環(huán)素、替卡西林/棒酸等11種抗生素均敏感；同時(shí)耐3種或3種以上抗生素的占總數(shù)80.00%，食物中毒菌株耐3種或3種以上抗生素的多重耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重，有6.70%副溶血性弧菌同時(shí)耐7種抗生素的耐藥株，研究表明要警惕由多重耐藥副溶血性弧菌引起的食源性疾病或食物中毒[9]。

1 材料與方法

1.1 樣品及菌株

樣品來(lái)自幾處水產(chǎn)市場(chǎng)的魚(yú)類、蝦類、蟹類、貝類等水產(chǎn)食品樣品，菌株有來(lái)自上述水產(chǎn)樣品中的副溶血性弧菌分離株及副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 17802。

1.2 主要試劑

副溶血性弧菌熒光 PCR檢測(cè)試劑盒（Reaction Mix、Taq polymerase）、裂解液lysis buffer，德國(guó)拜發(fā)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、SYBY GREEN I染料、VITEK2革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏卡AST-GN04，天根生化科技（北京）有限公司；3%氯化鈉堿性蛋白胨水（3% APW）、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、氯化鈉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；VITEK2革蘭氏陰性鑒定卡（GN鑒定卡），生物梅里埃美國(guó)股份有限公司；弧菌顯色培養(yǎng)基，法國(guó)科瑪嘉有限公司；瓊脂糖，Sigma-Aldrich；DS 2000 Marker，東盛生物科技有限公司。

1.3 引物

參考相關(guān)文獻(xiàn)中副溶血性弧菌的tdh、trh、tlh、toxR/S毒力基因引物，引物委托華大基因（深圳）有限公司進(jìn)行合成，詳見(jiàn)表1。

表1 副溶血性弧菌相關(guān)毒力基因的引物Table 1 List of Vibrio parahaemolyticus genes and primers

1.4 儀器與設(shè)備

PCR儀，ABI，Thermo Fisher賽默飛世爾（上海）有限公司；水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀Geldoc XR+、熒光PCR儀CFX96 Touch，Bio-Rad Laboratories，inc；VITEK 2 Compact自動(dòng)生化鑒定儀，法國(guó)梅里埃生物有限公司；超低溫冷凍柜，松下電器（中國(guó)）有限公司；生物安全柜Ⅱ級(jí)A2型，Thermo Fisher賽默飛世爾（上海）有限公司；微型離心機(jī)Mini-10K，杭州奧盛儀器有限公司；微型離心機(jī) C1301-230v，美國(guó)Labnet公司；生化培養(yǎng)箱KB240，賓德環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司；高壓滅菌鍋GR85DR，致微（廈門(mén)）儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 樣品采集

樣品來(lái)自2016年至2019年在南方某市幾處水產(chǎn)市場(chǎng)采集的魚(yú)類、蝦類、蟹類、貝類等152份市售水產(chǎn)食品樣品。

1.5.2 副溶血性弧菌分離鑒定

副溶血性弧菌分離具體方法參考《GB 4789.7-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》。鑒定部分如下：

生化鑒定：從 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板挑取適量菌落至3%無(wú)菌鹽水中，制成0.5~0.63麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，放入革蘭氏陰性鑒定卡后，利用VITEK2全自動(dòng)微生物生化鑒定儀進(jìn)行孵育檢測(cè)分析，待其完成檢測(cè)后，打印報(bào)告及分析結(jié)果。

熒光PCR鑒定：從3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板挑取適量菌落至裝有 500 μL生理鹽水的 EP管中，加入500 μL lysis buffer裂解液，再將EP管放至金屬浴中95 ℃裂解10 min后制成樣品DNA模板冷卻備用。PCR反應(yīng)體系：取5 μL樣品DNA模板，加入副溶血性弧菌熒光 PCR檢測(cè)試劑盒中 19.9 μL Reaction Mix和0.1 μL Taq polymerase，渦旋混勻并離心，總體積為25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃預(yù)變性15 s，60 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。待其完成檢測(cè)后，打印報(bào)告及分析結(jié)果。將上述副溶血性弧菌分離株從 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板挑取并轉(zhuǎn)入磁珠，放于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 副溶血性弧菌毒力基因鑒定

DNA模板的制備：取出-70 ℃保存的樣品副溶血性弧菌分離株，在 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上劃線，36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取適量菌落至裝有500 μL生理鹽水的EP管中，加入500 μL裂解液lysis buffer，再將EP管放至恒溫金屬浴中95 ℃裂解10 min后冷卻備用。PCR反應(yīng)體系：取DNA模板5 μL、上下游引物各 1 μL、12.5 μL 的 2×Taq PCR MasterMix、5.5 μL ddH2O，總體積25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃預(yù)變性 30 s，退火 30 s（退火溫度見(jiàn)表3），72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖至三角瓶中，加入適量的0.5×TBE電泳緩沖液，用微波爐加熱溶解瓊脂糖，配制成 2%的凝膠，凝膠取出后加入萬(wàn)分之一GeneGreen核酸染料，并搖勻。將膠槽放入制膠板中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，倒入溶解的瓊脂糖凝膠，待凝膠完全冷卻凝固后，垂直拔出梳子，將凝膠取出，放至電泳槽。電泳槽中0.5×TBE電泳緩沖液應(yīng)高于凝膠2 mm左右。吸取5 μL DNA模板加入點(diǎn)樣孔，及加入DS 2000 Marker（小孔上樣量為3 μL左右）。打開(kāi)電泳儀電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至80~100 V及合適的電泳時(shí)間（約60~90 min），開(kāi)始電泳。打開(kāi)電腦開(kāi)啟凝膠成像軟件 Image Lab，待電泳結(jié)束后取出凝膠置于凝膠成像儀檢測(cè)板進(jìn)行拍照檢測(cè)。

1.5.4 副溶血性弧菌藥敏試驗(yàn)

取出-70 ℃保存的副溶血性弧菌分離株，在3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上劃線，36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，從 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板挑取適量菌落至無(wú)菌生理鹽水中，制成0.5~0.63麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海傥?45 μL至3 mL無(wú)菌生理鹽水制成樣液，放入革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏卡AST-GN04，然后按相關(guān)操作至VITEK2全自動(dòng)微生物生化鑒定儀進(jìn)行孵育，待其完成檢測(cè)后，打印報(bào)告及分析結(jié)果。

VITEK2系統(tǒng)將參照對(duì)照反應(yīng)孔內(nèi)的生長(zhǎng)情況，評(píng)估每種細(xì)菌在存在抗菌藥物時(shí)的生長(zhǎng)模式。根據(jù)觀察到的多個(gè)生長(zhǎng)特征參數(shù)計(jì)算MIC值，根據(jù)鑒別性分析制訂算法，以便確定系統(tǒng)上針對(duì)所有抗菌藥物的敏感性結(jié)果。MIC結(jié)果必須與某種細(xì)菌鑒定相關(guān)聯(lián)，以便確定敏感性判讀。結(jié)果分為敏感（S），中介（I）和耐藥（R）來(lái)表示。敏感susceptible（S）是指使用常規(guī)劑量時(shí)，細(xì)菌能生長(zhǎng)繁殖可達(dá)到的抗菌藥物抑制濃度水平。中介 intermediate（I）是指常規(guī)劑量的抗菌藥物對(duì)細(xì)菌療效低于敏感菌株，藥物在濃度較大的部位有效或可使用高于正常劑量進(jìn)行治療。耐藥resistant（R）細(xì)菌不能被常規(guī)劑量的抗菌藥物所抑制，或能夠證明抑菌藥物濃度在某些特定細(xì)菌耐藥機(jī)制范圍內(nèi)。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)及表格是用Excel軟件進(jìn)行處理制作，凝膠電泳圖是用凝膠成像儀Geldoc XR+軟件生成，顯著性差異計(jì)算是用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢出結(jié)果分析

對(duì)152份水產(chǎn)樣品進(jìn)行副溶血性弧菌分離鑒定，其中有 21份樣品檢出副溶血性弧菌，檢出率為13.82%，并從中分離出以VITEK 2 Compact自動(dòng)生化鑒定儀及熒光 PCR兩種方法均鑒定為副溶血性弧菌的分離株60株。與其他研究對(duì)比分析，張健等對(duì)市售水產(chǎn)品致病菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌檢出率高于本研究中的檢出率，為 56.36%[11]。而林曉華等在2014年~2015年對(duì)生食水產(chǎn)品致病菌進(jìn)行檢測(cè)，其中副溶血性弧菌檢出率為7.56%[12]，本文副溶血性弧菌及其他致病菌檢出率較高的原因一是由于在研究過(guò)程中對(duì)水產(chǎn)樣品各部位均有采樣，未針對(duì)主要食用部分進(jìn)行采樣；二是由于本文實(shí)驗(yàn)樣品大多為需熟制烹飪加工才能食用的生鮮或冷凍水產(chǎn)品。

2.2 副溶血性弧菌生化鑒定結(jié)果分析

本節(jié)試驗(yàn)結(jié)果是通過(guò)VITEK2全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行孵育鑒定的，自動(dòng)生化儀中鑒定的每種細(xì)菌或某細(xì)菌群的試驗(yàn)反應(yīng)會(huì)和期望反應(yīng)作對(duì)比，系統(tǒng)用鑒定準(zhǔn)確率表示待測(cè)菌試驗(yàn)反應(yīng)會(huì)和期望反應(yīng)的相關(guān)程度[13]。通過(guò)本次研究，發(fā)現(xiàn)此 60株副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果是多樣化的，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)生化試驗(yàn)概率有所不同的項(xiàng)目有：甘露醇試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性率為93.33%，其中有1株陰性及2株弱陰性；β-半乳糖苷酶陰性率為93.33%，其中3株為陽(yáng)性，1株為弱陽(yáng)性；a-半乳糖苷酶陰性率為96.67%，其余2株為陽(yáng)性；尿素酶試驗(yàn)結(jié)果陰性率為 100%；賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果陰性率為41.67%，陽(yáng)性率為58.33%。結(jié)果的差異化反映了副溶血性弧菌屬在生長(zhǎng)繁殖代謝過(guò)程中存在種或亞種的區(qū)別，有可能獲得一些特殊的生化類型。而對(duì)副溶血性弧菌的生化項(xiàng)目進(jìn)行整理，有助于下一步毒力基因分布情況及耐藥性的分析。各副溶血性弧菌分離株的相關(guān)生化項(xiàng)目結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 60株副溶血性弧菌相關(guān)生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of 60 Vibrio parahaemolyticus

2.3 副溶血性弧菌毒力基因鑒定結(jié)果

2.3.1 部分副溶血性弧菌毒力基因 PCR鑒定圖譜

如toxR/S毒力基因（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為679 bp）。toxR/S毒力基因與其他毒力基因轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)相關(guān)，對(duì)60株副溶血性弧菌進(jìn)行toxR/S毒力基因篩查，發(fā)現(xiàn)均檢出toxR/S毒力基因，詳見(jiàn)圖1。

圖1 水產(chǎn)品副溶血性弧菌分離菌株的ToxR/S毒力基因PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification of ToxR/S gene of vibrio parahaemolyticus isolated from aquatic products

2.3.2 60 株副溶血性弧菌的4種毒力基因鑒定結(jié)果

60株副溶血性弧菌的毒力基因分布情況詳見(jiàn)表3。由表3可知：tdh基因陽(yáng)性有 57株（攜帶率為95.00%），trh基因陽(yáng)性有39株（攜帶率為65.00%），tlh基因攜帶率為 100.00%，toxR/S基因攜帶率為100.00%，其中攜帶四重毒力基因的菌株有37株（攜帶率為61.67%），婁陽(yáng)[14]對(duì)上海市不同來(lái)源副溶血性弧菌tdh基因和trh基因進(jìn)行檢測(cè)，其tdh基因攜帶率為88.10%，trh基因攜帶率為為28.57%，較低于本文的攜帶率。

表3 60株副溶血性弧菌的4種毒力基因鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of 4 virulence genes of 60 Vibrio parahaemolyticus

從不同水產(chǎn)品類分析，此 60株副溶血性弧菌在tdh基因攜帶率方面，魚(yú)類分離株攜帶率為 93.33%（28/30），蟹類分離株攜帶率為100.00%（15/15），貝類分離株攜帶率為91.67%（11/12）；在trh基因攜帶率方面，魚(yú)類分離株攜帶率為96.67%（29/30），蟹類分離株攜帶率為 46.67%（7/15），貝類分離株攜帶率為 16.67%（2/12），魚(yú)類與蟹類、貝類攜帶率均有顯著性差異（魚(yú)類與蟹類攜帶率 x2=12.66，p<0.05，魚(yú)類與貝類攜帶率x2=22.80，p<0.05。）

結(jié)合生化鑒定結(jié)果分析，有研究發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌的脲酶與人的感染聯(lián)系不大，但也有試驗(yàn)表明脲酶陽(yáng)性菌株與trh之間呈正相關(guān)[3,4]。本文檢出攜帶trh毒力基因的菌株有39株，而尿素酶試驗(yàn)中60株菌株均為陰性，未發(fā)現(xiàn)尿素酶陽(yáng)性的菌株，未能對(duì)尿素酶與其致病性存在的關(guān)系進(jìn)行判斷分析。

VP1913 鮑魚(yú) + + + + 4 VP1914 紅蟹 + - + + 3 VP1915 鮑魚(yú) + - + + 3 VP1916 鮑魚(yú) + - + + 3 VP1917 花螺 + - + + 3 VP1918 鮑魚(yú) + - + + 3 VP1919 蟹 + + + + 4 VP1920 蟹 + - + + 3 VP1921 蟹 + - + + 3 VP2001 蟹 + + + + 4 VP2002 蟹 + - + + 3 VP2003 蟹 + + + + 4 VP2004 蟹 + + + + 4 VP2005 蟹 + - + + 3 VP2006 蟹 + + + + 4 VP2007 蟹 + - + + 3 VP2008 蟹 + + + + 4 VP2009 龍蝦 + + + + 4 VP2010 鮑魚(yú) + + + + 4 VP2011 蟹 + + + + 4合計(jì) 57 39 60 60檢出率/% 95.00 65.00 100.00 100.00

2.4 副溶血性弧菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)VITEK2全自動(dòng)生化鑒定儀對(duì)60株副溶血性弧菌的19種抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。從表4可知，此60株分離自水產(chǎn)品的副溶血性弧菌對(duì)氨芐西林有極高的耐藥性，耐藥率為96.67%，申進(jìn)玲等對(duì)上海進(jìn)口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌耐藥性研究中氨芐西林耐藥率為98.53%，與本文結(jié)果相似[15]。而分離株對(duì)由舒巴坦和氨芐西林共同組成的混合物氨芐西林/舒巴坦則均為敏感；有4株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲惡唑呈現(xiàn)耐藥，其余均為敏感；對(duì)頭孢呋辛及頭孢呋辛酯的測(cè)試結(jié)果大多為中介；有4株對(duì)哌拉西林呈中介，其余均為敏感。

表4 60株副溶血性弧菌對(duì)19種抗菌藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果Table 4 60 strains of Vibrio parahaemolyticus exposed to 19 kinds of antibiotics sensitivity test results

60株副溶血性弧菌的多重耐藥情況詳見(jiàn)表5。從表5可知，僅有4株菌株有2重耐藥，多重耐藥現(xiàn)象不突出。耐2種藥物的菌株主要來(lái)自魚(yú)類；耐1種藥物及對(duì)3種藥物呈中介的菌株則在魚(yú)類、貝類及蝦類均有檢出。

表5 60株副溶血性弧菌中具有較多耐藥的菌株一覽表Table 5 List of strains with more drug resistance in 60 Vibrio parahaemolyticus

結(jié)合生化結(jié)果分析，耐2種藥物的菌株VP1604、VP1606、VP1607均與副溶血性弧菌典型生化相符，菌株VP1609的D-甘露醇結(jié)果為陰性，其余項(xiàng)目與副溶血性弧菌典型生化相符。耐1種藥物及對(duì)3種藥物呈中介的4株菌株均與副溶血性弧菌典型生化相符。

結(jié)合毒力基因結(jié)果分析，耐2種藥物的4株菌株均具有4重毒力；耐1種藥物及對(duì)3種藥物呈中介的菌株VP1628、VP2009、VP2010具有4重毒力，VP1916則具有3重毒力。不攜帶tdh及trh毒力基因的菌株VP1912對(duì)此19種藥物不呈現(xiàn)耐藥性，對(duì)氨芐西林、頭孢呋辛及頭孢呋辛酯此3種藥物呈現(xiàn)中介。本研究中 60株食源性副溶血性弧菌分離株大多具有臨床菌株的特征基因，譚海芳等在對(duì)肇慶市副溶血性弧菌耐藥性研究時(shí)指出，由于近年來(lái)抗生素的大量使用，各食源性病原菌耐藥株日益增多，當(dāng)出現(xiàn)耐3種或3種以上藥物時(shí)，要警惕超級(jí)耐藥株引起的副溶血性弧菌食源性疾病[16]。隨著對(duì)副溶血性弧菌的致病機(jī)制和藥敏性的研究越來(lái)越多。

3 結(jié)論

3.1 對(duì)60株副溶血性弧菌的典型生化項(xiàng)目特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其生化反應(yīng)結(jié)果是多樣化的，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)等項(xiàng)目結(jié)果與常規(guī)生化試驗(yàn)概率有所不同。

3.2 對(duì)60株副溶血性弧菌分離株的毒力基因進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)毒力基因分布如下：tdh基因攜帶率95.00%，trh基因攜帶率為65.00%，tlh基因攜帶率為100.00%，toxR/S基因攜帶率為100.00%，其中四重毒力基因攜帶率61.67%，結(jié)果表明分離株具有較高的毒力基因攜帶率，且多數(shù)攜帶多重毒力基因。攜帶 trh毒力基因的菌株有39株，而尿素酶試驗(yàn)中60株菌株均為陰性，未發(fā)現(xiàn)尿素酶陽(yáng)性的菌株，未能對(duì)尿素酶與其致病性存在的關(guān)系進(jìn)行判斷分析。

3.3 對(duì)60株副溶血性弧菌的耐藥性進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)60株菌株均對(duì)氨芐西林有極高的耐藥性，耐藥率為96.67%；有4株對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲惡唑呈現(xiàn)耐藥；但對(duì)由舒巴坦和氨芐西林共同組成的混合物氨芐西林/舒巴坦則均為敏感。多重耐藥現(xiàn)象不突出，僅有4株菌株對(duì)2種藥物耐藥，主要來(lái)自魚(yú)類；耐1種藥物及對(duì)3種藥物呈中介的菌株則在魚(yú)類、貝類及蝦類均有檢出。耐2種藥物的4株菌株均具有4重毒力，不攜帶tdh及trh毒力基因的菌株VP1912對(duì)此19種藥物不呈現(xiàn)耐藥性。結(jié)果表明分離株耐藥情況不突出，但對(duì)抗菌類藥物氨芐西林的耐藥率較高，需警惕水產(chǎn)食品中副溶血性弧菌的潛在威脅。

4 展望

隨著人們對(duì)食品安全需求的日益增長(zhǎng)及水產(chǎn)品市場(chǎng)的逐漸發(fā)展，針對(duì)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的致病機(jī)制和藥敏性的研究越來(lái)越多。因時(shí)間和條件所限，本研究還有很多實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步開(kāi)展，如結(jié)合相關(guān)生化及毒理實(shí)驗(yàn)對(duì)副溶血性弧菌的毒力表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)合耐藥基因篩查對(duì)藥敏性進(jìn)行深入研究等，以挖掘更多潛在的毒力及耐藥因子，探索副溶血性弧菌致病機(jī)制和藥敏性之間的關(guān)系，為副溶血性弧菌的快速檢測(cè)及防控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。