楊曉君，周靜，謝元，王秋平，丁澤人，趙立艷，金鵬

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052）（3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210000）

殼聚糖是一種廣泛存在于自然界中的可再生、無(wú)毒副作用、生物相容性和降解性良好的天然氨基多糖，其自身及其衍生物具有許多獨(dú)特的生理、藥理功能性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥[1,2]、食品[3-6]、農(nóng)業(yè)[7]等多種行業(yè)領(lǐng)域中。殼聚糖的水溶性和成膜性一直是限制其在保鮮上應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題[8,9]，其吡喃環(huán)上含有活潑的-OH、-NH2，在N或O上可引入其他活性基團(tuán)，改善其溶解性和生物活性；還可以利用O或N原子的孤對(duì)電子配位抑或利用交聯(lián)劑交聯(lián)以致產(chǎn)生新的活性功能和新的材料特性；拓展殼聚糖及其衍生物的應(yīng)用領(lǐng)域以及殼聚糖的配位化學(xué)研究，開(kāi)展殼聚糖及其衍生物金屬配合物的制備[10]、結(jié)構(gòu)[11]、理化性質(zhì)[12]和功能活性研究[13]是重要的研究方向之一。近年來(lái)，殼聚糖在不同領(lǐng)域的應(yīng)用研究日益增多，并且都取得了一定的進(jìn)展，各學(xué)科的相互滲透與交叉，不斷拓展了殼聚糖的改性方法，提高了殼聚糖的生物活性，同時(shí)賦予其更多功能。殼聚糖改性產(chǎn)物已經(jīng)在果蔬保鮮[14]、紡織[15]、環(huán)境微生物污染防治[16,17]、患者周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)[18]等方面展現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景，各種改性方法的不斷改進(jìn)是殼聚糖發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)保障。

SO2保鮮是葡萄貯藏化學(xué)保鮮的主要方法[19]，傳統(tǒng)的SO2處理保鮮是使用亞硫酸鹽潮解釋放出SO2氣體，若總投放量低則保鮮效果不佳；若總投放量高則會(huì)出現(xiàn)SO2殘留高、葡萄易漂白的現(xiàn)象[20]。因此，亟需開(kāi)發(fā)SO2殘留少、使用方便、釋放穩(wěn)定的SO2葡萄保鮮劑以滿(mǎn)足當(dāng)下葡萄采后保鮮的市場(chǎng)需求。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)發(fā)出多種葡萄貯藏保鮮技術(shù)，如賈曉昱等[21]采用脈沖式防腐設(shè)備精準(zhǔn)定量控制SO2循環(huán)熏蒸，貯藏180 d時(shí)，腐爛率僅為3.9%，漂白指數(shù)為0.3，且SO2殘留量為3.1 mg/kg。焦旋等[22]研制的二氧化硫精準(zhǔn)釋放葡萄保鮮片皆在追求低殘留和穩(wěn)定釋放的SO2保鮮技術(shù)。

本研究以殼聚糖為主要原料，選擇能在食品上應(yīng)用的、安全性高的有機(jī)金屬鹽，利用金屬離子絡(luò)合配位法對(duì)殼聚糖改性，制備具有SO2催化釋放中心的殼聚糖骨架分子A。一方面以膠體硫、二氯代烷烴與多硫化鈉反應(yīng)制得的聚硫膠為硫化劑對(duì) A進(jìn)行硫化淺交聯(lián)及殼聚糖分子骨架硫化摻雜，形成含硫殼聚糖骨架大分子B，作為葡萄保鮮貯藏前期較高濃度SO2緩釋劑；另一方面將A作為包埋劑，選擇非水極性溶劑分散共混、固相捏合、兩相高速剪切分散對(duì)亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽[23]進(jìn)行包埋，制備改性殼聚糖SO2緩釋包埋產(chǎn)物C，作為葡萄保鮮貯藏中后期SO2平穩(wěn)長(zhǎng)效緩釋劑；最后采用高速剪切法將B與C混合，乙醇/丙酮沉淀制備殼聚糖型SO2緩釋材料。本研究選擇用安全性高的金屬離子改性殼聚糖結(jié)合傳統(tǒng)的亞硫酸鹽包埋制作能夠緩釋SO2的材料相對(duì)于其他產(chǎn)品增加了一定抑菌性以及緩釋SO2的效果。CS-SO2SM制作工藝如下。

依據(jù)上述制備工藝，篩選金屬離子和硫化劑，應(yīng)用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，以SO2釋放量、釋放曲線(xiàn)及抑菌圈直徑為綜合考察指標(biāo)，通過(guò)場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡-能譜儀對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，傅里葉紅外光譜儀考察其官能團(tuán)的變化，確定殼聚糖型SO2緩釋材料制備工藝，為后續(xù)將該材料應(yīng)用于葡萄保鮮提供物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度97%），江蘇瑞多生物有限公司；焦硫酸鈉（分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫代硫酸鈉（分析純），天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；四硫化雙五亞甲基秋蘭姆（TRA，純度≧98%）、二硫化四甲基秋蘭姆（TMTD，純度≧98%），上海麥克林生化科技有限公司；沉淀硫（化學(xué)純），天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；灰葡萄孢，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Quanta 250-EDS場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡，美國(guó)FEI儀器公司；Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；85-2控溫磁力攪拌器，江蘇金怡儀器科技有限公司；XH-D旋渦混合器，上海左樂(lè)儀器有限公司；pHS-3E酸度計(jì)，天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CS-SO2SM制備工藝的考察

1.3.1.1 金屬離子篩選

按照課題組殼聚糖型 SO2緩釋材料的制備方法[24]，以50和150 ku殼聚糖為原料，硫化劑為四硫化雙五亞甲基秋蘭姆（TRA），設(shè)定金屬離子為Cu2+、Zn2+，采用碘量法測(cè)定SO2釋放量，連續(xù)測(cè)定60 d，選出合成CS-SO2SM的最佳金屬離子。

1.3.1.2 硫化劑篩選

以50和150 ku殼聚糖為原料，金屬離子為1.3.1.1實(shí)驗(yàn)選出，設(shè)定硫化劑為T(mén)RA、二硫化四甲基秋蘭姆（TMTD），同1.3.1.1方法測(cè)定SO2釋放量，選出合成CS-SO2SM的最佳硫化劑。

1.3.2 析因?qū)嶒?yàn)優(yōu)化CS-SO2SM制備工藝

前期研究結(jié)果表明，硫化劑和焦亞硫酸鈉用量、含硫殼聚糖骨架大分子B與改性殼聚糖SO2緩釋包埋產(chǎn)物C的混合時(shí)間對(duì)SO2釋放的影響較大，所以采用3因子3水平的完全析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，以SO2釋放曲線(xiàn)、釋放天數(shù)為主要考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)分，優(yōu)化CS-SO2SM制備工藝，綜合評(píng)分公式如下：

綜合評(píng)分=SO2釋放曲線(xiàn)占50分+SO2釋放天數(shù)占50分

（1）SO2釋放曲線(xiàn)評(píng)分方法：先上升后逐漸下降較為符合葡萄保鮮的曲線(xiàn)記為4~5分，基本符合記2~3分，有SO2釋放記0~1分。

（2）SO2釋放天數(shù)評(píng)分方法：總釋放天數(shù)為40 d，釋放天數(shù)/40×5。

3×3 ×3 析因?qū)嶒?yàn)因素水平表見(jiàn)表1，完全的3×3×3析因?qū)嶒?yàn)共進(jìn)行 27次實(shí)驗(yàn)，以確定每個(gè)因素的貢獻(xiàn)率。

表1 3×3×3析因?qū)嶒?yàn)因素水平表Table 1 3×3×3 Factorial experimental factor level

1.3.3 CS-SO2SM的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡

取0.5 mg樣品置于樣品艙中，在壓力130 Pa，保壓時(shí)間30 μs下進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.3.2 紅外光譜檢測(cè)

將樣品與溴化鉀按質(zhì)量比1:100充分混合壓制溴化鉀片，置于樣品室中進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 SO2釋放量測(cè)定

按照如下方法測(cè)定在室溫環(huán)境下每天釋放的SO2變化量及變化趨勢(shì)：將1 g樣品置于磨口錐形瓶中，室溫放置48 h后取出，然后在磨口錐形瓶中迅速加入去離子水100 mL和10.5 mol/L NaOH溶液1 mL，放置30 min，淀粉指示劑2 mL，0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)液滴定，記錄體積，計(jì)算SO2釋放量，同法做空白實(shí)驗(yàn)。公式如下：

式中N為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）；V1為滴定試樣時(shí)消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（L）；V0為滴定空白試樣消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（L）。

1.3.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

參考了Tan等[25]的方法并加以修改，采用析因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果選取較優(yōu)配方，使用灰葡萄孢菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.3.5.1 菌懸液的制備

使用菌用接種環(huán)挑取少許菌落置于裝有無(wú)菌水的試管內(nèi)，渦旋混勻，制成菌懸液，待用。

1.3.5.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

取直徑6 mm的滅菌濾紙放入不同配方、相同濃度的保鮮劑（1%甲酸溶液作溶劑）中浸泡。取上述菌懸液40 μL均勻涂布于培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將浸有保鮮劑溶液的濾紙貼于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿貼4片，并用浸有1%甲酸溶液的濾紙作對(duì)照，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后取出觀(guān)察并測(cè)定其抑菌圈直徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉX+SD）表示，用SPSS 21.0版統(tǒng)計(jì)軟件中的多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著。用Origin9.1作圖軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子對(duì)CS-SO2SM釋放SO2的影響

14.6 ℃，最大濕差為25%。由圖1可知，Cu2+合成的CS-SO2SM釋放曲線(xiàn)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第4 d釋放量最大，其釋放量為31.36 mg/g，5~60 d呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，并且整個(gè)釋放過(guò)程中SO2的釋放量隨著環(huán)境溫濕度的改變較為穩(wěn)定；Zn2+合成的CS-SO2SM釋放曲線(xiàn)在第40 d釋放量最大，其釋放量為32.64 mg/g，在整個(gè)釋放過(guò)程中SO2的釋放量隨著溫濕度的改變而出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象較多，其中有16 d無(wú)SO2的釋放。通過(guò)對(duì)比上述兩種金屬離子絡(luò)合產(chǎn)物SO2的釋放曲線(xiàn)可知，選擇Cu2+對(duì)絡(luò)合配位改性殼聚糖合成CS-SO2SM，其SO2釋放曲線(xiàn)符合葡萄保鮮曲線(xiàn)特征[26]。

圖1 不同金屬離子緩釋材料的SO2釋放量Fig.1 SO2 release from different metal ion sustained-release materials

2.2 硫化劑對(duì)CS-SO2SM釋放SO2的影響

由圖2可知，TRA合成的CS-SO2SM釋放曲線(xiàn)有先上升后下降的趨勢(shì)，第4 d釋放量最大，其釋放量為18.56 mg/g，5~60 d呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)；TMTD合成的CS-SO2SM釋放曲線(xiàn)呈現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象，其中有18 d無(wú)SO2的釋放。通過(guò)對(duì)比上述兩條SO2的釋放曲線(xiàn)可知，在使用 Cu2+絡(luò)合配位改性殼聚糖時(shí)，TRA合成的CS-SO2SM更加穩(wěn)定且能持久釋放SO2。

圖2 不同硫化劑緩釋材料的SO2釋放量Fig.2 SO2 release from different sulfur release agents

2.3 析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

由表2可知，最大的綜合值為10，其對(duì)應(yīng)的組合水平是A3B3C2，即TRA加入量0.5 g、焦硫酸鈉加入量0.5 g與混合攪拌時(shí)間1.5 h的制備工藝為最佳。

表2 綜合評(píng)分表Table 2 Scoring table

由表3可以看出，TRA加入量，焦亞硫酸鈉加入量和混合攪拌時(shí)間對(duì) SO2釋放量的影響極顯著（p<0.01），且三者均有顯著交互作用（p<0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

殼聚糖可通過(guò)化學(xué)法、物理法及生物方法等改性[27-29]，本研究利用析因?qū)嶒?yàn)法對(duì)硫化改性的殼聚糖配方進(jìn)行優(yōu)化。析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)主要用于分析各因素和交互作用，尋找最佳組合。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，TRA加入量，焦亞硫酸鈉加入量和混合攪拌時(shí)間對(duì)CS-SO2SM制備有顯著影響，通過(guò)析因?qū)嶒?yàn)得到最佳制備工藝為50和150 ku殼聚糖1 g溶于甲酸溶液中，磁力攪拌下滴加與殼聚糖等摩爾質(zhì)量的硫酸銅溶液，攪拌 3 h，加氨水調(diào)pH至6左右繼續(xù)攪拌3 h，即得產(chǎn)物A；然后加入0.5 g TRA沉淀硫混合物（1:1）和1 mL乳化劑，60 ℃攪拌1 h即得產(chǎn)物B；產(chǎn)物A中加入0.5 g硫代硫酸鈉、0.5 g焦硫酸鈉和1 mL乳化劑，60 ℃攪拌1 h，即得產(chǎn)物C；最后將產(chǎn)物B與C按1:1（V/V）混合，60 ℃攪拌1.5 h，加入乙醇/丙酮（1:1，V/V）混合溶液，放置，抽濾，沉淀物用75%、95%、100%乙醇依次洗滌，60 ℃烘干，即得CS-SO2SM。

2.4 CS-SO2SM的結(jié)構(gòu)表征

材料表征主要分為元素分析、分子與固態(tài)分析、表面表征技術(shù)，常用的檢測(cè)方法有原子吸收光譜、X-衍射、紅外光譜、拉曼光譜、熱分析、紫外光譜、電子顯微鏡等[30,31]，本研究應(yīng)用紅外光譜、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡-能譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

2.4.1 場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡-能譜檢測(cè)

在掃描電鏡下，合成中間產(chǎn)物A（圖4）與殼聚糖原料（圖3）相比較，A不再是常見(jiàn)殼聚糖高分子無(wú)定形玻璃態(tài)，而是轉(zhuǎn)化為類(lèi)半結(jié)晶性的團(tuán)粒狀，這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò) Cu→N配位后改變了殼聚糖鏈的極性，利于結(jié)晶。產(chǎn)物B（圖5）的形態(tài)從A的半結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)化為類(lèi)低聚橡膠常表現(xiàn)出的片絮狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物B是在產(chǎn)物A基礎(chǔ)上進(jìn)一步交聯(lián)硫化的結(jié)果。產(chǎn)物C（圖6）是產(chǎn)物A將硫酸鹽包埋，結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于產(chǎn)物A，CS-SO2SM為半結(jié)晶與片絮狀的無(wú)定混合態(tài)，這與終產(chǎn)物即是產(chǎn)物B與產(chǎn)物C共混的結(jié)果相關(guān)。

圖3 殼聚糖電鏡圖（3000×）Fig.3 Chitosan electron micrograph (3000×)

圖4 產(chǎn)物A電鏡圖（3000×）Fig.4 Electron micrograph of compound A (3000×)

圖5 產(chǎn)物B電鏡圖（3000×）Fig.5 Electron micrograph of compound B (3000×)

圖6 產(chǎn)物C電鏡圖（3000×）Fig.6 Electron micrograph of compound C (3000×)

產(chǎn)品CS-SO2SM為黑褐色固體粉末（圖7）。由殼聚糖原料合成殼聚糖型 SO2緩釋材料的各中間產(chǎn)物，在電鏡下的形態(tài)發(fā)生了相應(yīng)的改變（圖8）。由能譜儀元素分析（圖9）可知，C、O、Cu、S的原子含量分別是 69.68%、22.70%、2.92%、4.70%；歸一化質(zhì)量分別是54.48%、23.65%、12.07%、9.81%。

圖7 CS-SO2SMFig.7 Chitosan type SO2 sustained material

圖8 CS-SO2SM電鏡圖（3000×）Fig.8 Electron micrograph of CS-SO2SM (3000×)

圖9 CS-SO2SM能譜圖Fig.9 CS-SO2SM spectrum

2.4.2 紅外光譜檢測(cè)

CS-SO2SM紅外光譜圖中（圖10），與50、150 ku殼聚糖相比，殼聚糖的特征吸收峰峰Ⅰ（-OH和-NH伸縮振動(dòng)吸收峰）、峰Ⅱ（C-H伸縮振動(dòng)吸收峰）和峰Ⅲ、Ⅳ（酰胺吸收峰）均出現(xiàn)[32]，并發(fā)生不同程度的藍(lán)移，且透過(guò)率明顯增大，這是Cu→N配位產(chǎn)生吸收峰向高波數(shù)移動(dòng)的結(jié)果。綜合掃描電鏡-能譜儀和FT-IR分析，結(jié)果表明成功合成了以殼聚糖為骨架的緩釋材料CS-SO2SM。

圖10 CS-SO2SM紅外光譜Fig.10 Infrared spectrum of CS-SO2SM

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

通過(guò)析因?qū)嶒?yàn)選取三個(gè)較優(yōu)配方做抑菌試驗(yàn)。由表4可知，三者均有抑菌作用，其中26號(hào)（A3B3C2）抑菌圈最大（p<0.01），抑菌性能為最佳，與析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果基本一致。

表4 抑菌效果Table 4 Bacteriostatic effect

3 結(jié)論

本研究選用殼聚糖為原料，采用金屬離子配位反應(yīng)、硫化反應(yīng)和包埋技術(shù)通過(guò)共混、交聯(lián)制備了殼聚糖型 SO2緩釋材料。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出 Cu2+與TRA分別作為金屬離子和硫化劑，3×3×3析因?qū)嶒?yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了適合該材料的配方為T(mén)RA 0.5 g、焦亞硫酸鈉0.5 g、攪拌1.5 h。綜合掃描電鏡-能譜儀和FT-IR分析，CS-SO2SM是以殼聚糖為骨架，經(jīng)過(guò)銅離子配位反應(yīng)、膠硫化和硫酸鹽包埋形成的黑褐色固體粉末。抑菌實(shí)驗(yàn)表明抑菌圈平均直徑為20.33 mm，具有最佳抑菌效果，與析因結(jié)果相同。本研究中制備的CS-SO2SM的SO2釋放曲線(xiàn)具備葡萄保鮮曲線(xiàn)特征，有望成為一種新型SO2保鮮劑。