呂敏，甘暉，何金釗，馮鵬霏，付玉春，陳秀荔，趙永貞，覃良舉，馬華威

（1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530036）（2.廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校水產(chǎn)系，廣西南寧 530035）（3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)引育種中心，廣西南寧 530031）（4.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程系，廣西南寧 530073）（5.廣西鮮之益投資有限公司，廣西南寧 530044）

羅非魚（Tilapia mossambica），是世界及我國重要經(jīng)濟(jì)淡水魚類，隨著羅非魚養(yǎng)殖和加工出口量與日俱增，對(duì)其進(jìn)行魚片加工或魚糜加工時(shí)需要?jiǎng)冸x的魚皮也隨之逐年增多[1,2]。魚皮是漁業(yè)加工的副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量很高，較魚肌肉中蛋白質(zhì)還要高，其中膠原蛋白的含量占其蛋白質(zhì)總量的80%以上[3]。然而，具有健脾止痢、潤肺止咳、補(bǔ)腎益肝、補(bǔ)胃催乳、營養(yǎng)滋補(bǔ)、去濕等功能的羅非魚皮，往往被作為水產(chǎn)品加工業(yè)的下腳料不被人們重視[4]。近幾年魚皮的價(jià)值逐漸被許多國家認(rèn)識(shí)，魚皮是食品工業(yè)、醫(yī)藥及化工生產(chǎn)的重要原料，充分利用魚皮資源，開發(fā)魚皮制品，已經(jīng)成為淡水魚下腳料綜合利用的重要方面[5]。在食品加工領(lǐng)域，魚皮常常被開發(fā)成即食食品、調(diào)理食品、水發(fā)預(yù)制品等，魚皮食品加工產(chǎn)業(yè)前景十分廣闊。

水產(chǎn)品由于保鮮不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致其在加工、貯藏、銷售和流通過程中極易引起微生物繁殖，造成腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生異味和肉質(zhì)惡化[6,7]。微生物主要在水產(chǎn)品體表面和腸道繁殖，其生長和代謝是水產(chǎn)加工過程中造成腐敗變質(zhì)的主要原因[8]。致腐微生物區(qū)系的改變能引起水產(chǎn)品腐敗形態(tài)和化學(xué)性質(zhì)變化，特別是優(yōu)勢(shì)腐敗菌繁殖所產(chǎn)生的代謝物能造成水產(chǎn)品體內(nèi)大分子破壞和肌肉自溶，導(dǎo)致組織失去彈性和產(chǎn)生異味[9]。當(dāng)前，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的食品腐敗菌占總菌群的比例小，不足以揭示導(dǎo)致食品腐敗的總菌群，而新一代高通量測(cè)序技術(shù)不斷應(yīng)用為深入研究水產(chǎn)品貯藏過程的微生物區(qū)系提供了技術(shù)支撐[10]。16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)是當(dāng)前研究食品腐敗或食品發(fā)酵的常用方法，可獲得易于分析的數(shù)千個(gè)序列，能快速、可靠地識(shí)別數(shù)量較多的食品微生物[11,12]。不同的魚皮由于脂肪、水份、蛋白質(zhì)、多糖等組成組分差異，導(dǎo)致微生物豐度和多樣性也不同，分析微生物區(qū)系在時(shí)間軸演變規(guī)律是研究魚皮食品加工與保鮮的首要任務(wù)，為研究與羅非魚皮貯存條件相關(guān)的腐敗菌群及抑制魚皮腐敗變質(zhì)提供有價(jià)值信息[13-15]。因此，研究羅非魚皮貯藏過程中微生物區(qū)系，分析其腐敗菌群演變規(guī)律，有針對(duì)性實(shí)施有效保鮮技術(shù)，對(duì)品質(zhì)控制具有重要研究價(jià)值。

沒食子酸（GA，3,4,5-三羥基苯甲酸），又稱五倍子酸，是從各種植物、水果和蔬菜中提取的一種天然多羥基苯酚化合物，對(duì)人體安全無害[16,17]。紫外線（以下簡稱 UV）能抑制多種浮游細(xì)菌、生物膜和真菌，這與它產(chǎn)生活性氧（ROS）和分解細(xì)菌膜的能力有關(guān)[18-20]。然而，GA 對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）O157:H7等食品常見菌的抑制作用較弱，因?yàn)樾枰狦A濃度高、處理時(shí)間長，并且無法滅活高密度穩(wěn)定期菌群。據(jù)研究稱，穩(wěn)定期E.coliCETE 434在15 mM GA暴露60 min后，僅減少1 log(CFU/mL)[21]。另有研究表明，GA抑制穩(wěn)定期的Staphylococcus aureus和E.coliO157:H7的最小抑制濃度均為2500 mg/L[22]。因此，單獨(dú)使用GA保鮮食品有局限性，為了提高酚類物天然抑菌活性物的抑菌殺菌效力，目前，常采用多種保鮮方式相結(jié)合的協(xié)同抑菌殺菌方法[23]。基于光動(dòng)力增強(qiáng)生物活性保鮮劑抗菌活性是一種新型非熱殺菌方法，包括紫外線、藍(lán)光及其它光譜動(dòng)力輻照增強(qiáng)天然生物活性保鮮劑[24]。Nakamura等人采用不同類型光輻照多種酚類溶液，獲得高殺菌抑菌的新型抗菌液，如咖啡酸、GA和花青素均與藍(lán)光結(jié)合能有效抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌[25]。Cossu等人建立了 GA和紫外線長波UV-A協(xié)同殺菌技術(shù)，能破壞菠菜表面的E.coliO157:H7生物膜[26]。苯甲酸或姜黃素被UV-A或可見光輻射24 h后，抑制菠菜表面細(xì)菌總菌群數(shù)顯著高于未經(jīng)任何輻射的苯甲酸或姜黃素[27,28]。然而，魚皮的組成成分與果蔬、肉質(zhì)差異很大，微生物區(qū)系和腐敗變質(zhì)情況不相同，基于光譜學(xué)的殺菌技術(shù)是否有效抑制魚皮表面腐敗菌并保持其新鮮尚未知。

本研究在光譜學(xué)非熱殺菌方法與GA相結(jié)合的殺菌技術(shù)基礎(chǔ)上，采用UV-C輻照GA生成UVC-GA抗菌液，處理羅非魚皮后0 ℃冷藏8 d，采用16S rRNA llumina-MiSeq高通量測(cè)序方法研究冷藏過程中羅非魚皮微生物區(qū)系在時(shí)間軸演變規(guī)律，分析指示魚皮品質(zhì)的化學(xué)指標(biāo)，如感官指標(biāo)、總揮發(fā)性鹽基氮（Total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、ATP復(fù)合物、K值、pH、生物胺和菌落總數(shù)（Total viable colony，TVC）變化，為UVC-GA抗菌液應(yīng)用于0 ℃冷藏羅非魚皮的品質(zhì)控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大小均一的新鮮羅非魚皮由廣西小研人生物有限公司提供，每張魚皮平均重量為20.14±3.32 g。GA（食品級(jí)），北京博奧拓達(dá)科技有限公司；EX1800瓊脂糖凝膠（純度 99%），北京金克隆生物技術(shù)有限公司；ATP復(fù)合物，美國Sigma公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒，美國 Axygen生物科學(xué)公司；QuantiFluor?-ST微型熒光劑，美國Promega公司；高氯酸溶液，上海紫一試劑廠；PCA溶液，青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 高效液相色譜儀，美國 AGILENT公司；Mastercycler X50梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，Eppendorf中國有限公司；Illumina-MiSeq測(cè)序儀，美國Illumina公司；2500XP數(shù)顯pH計(jì)，上海生工生物工程公司；凱氏定氮儀，山東盛泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備UVC-GA抗菌液

實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)式UV-C間歇式光源，波長為254 nm，平均強(qiáng)度為4540 μW/cm2，最大液體穿透力為17 cm。將GA用去離子水（DI）稀釋至0.15 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)濃度，轉(zhuǎn)移至滅菌晶體培養(yǎng)皿，在UV室中以 4 J/cm2強(qiáng)度持續(xù)輻照12 h。采用0.25 μm孔徑的無菌過濾器過濾輻照后的GA，獲得UVC-GA抗菌液并黑暗處室溫儲(chǔ)存，為保證UVC-GA抗菌活性的穩(wěn)定性，儲(chǔ)存不超過4周[25]。

1.3.2 魚皮樣品處理

新鮮羅非魚皮清洗去污，隨機(jī)均勻分為3組，每組28張魚皮，即去離子無菌水（DI）、GA、UVC-GA三個(gè)處理組。每組魚皮樣品分別在對(duì)應(yīng)處理組和對(duì)照組按2:1（m/V）的比例浸泡10 min，隨后將3組樣品從溶液中取出，分別用聚氯乙烯袋包裝后冰箱0 ℃冷藏，隨機(jī)在0、2、4、5、6、7、8 d選取樣品進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 Illumina-MiSeq技術(shù)分析微生物區(qū)系組成

參考Liu等的方法[12]提取細(xì)菌DNA，取5 g魚皮樣品，用PCR方法擴(kuò)增了16S rRNA基因的V3~V4區(qū)，PCR條件：95 ℃變性3 min；95 ℃退火30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)27 次；72 ℃延伸 10 min。引物為 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′）。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠提取擴(kuò)增產(chǎn)物后，AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，QuantiFluor?-ST微型熒光劑定量分析DNA含量。然后，等摩爾量樣品利用Illumina-MiSeq配對(duì)測(cè)序（2×300 bp），初始讀數(shù)導(dǎo)入NCBI序列讀取存檔（SRA）數(shù)據(jù)庫，利用 QIIME（version 1.17）對(duì)初始fastq文件進(jìn)行多路分解和質(zhì)量過濾。隨后用 UPARSE（version 7.1）（http://drive5.com/uparse/）以97%的相似性進(jìn)行聚類分析可操作分類單位（英文全稱，OTUs），再采用UCHIME識(shí)別和刪除嵌合序列，基于Silva（SSU115），置信閾值設(shè)為 70%，用 RDP分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每個(gè)16S rRNA基因序列進(jìn)行分類。最后采用 Unifrac距離加權(quán)法進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA），研究菌群差異。

1.3.3.2 TVB-N、TVC和pH值測(cè)定

用半微量水蒸氣蒸餾法測(cè)定TVB-N含量[29]，將5 g魚皮和50 mL蒸餾水倒入勻漿機(jī)，勻漿破碎30 min獲得混合液體，混合液在1600 r/min離心3 min后收集上清液，以凱氏定氮儀測(cè)定其中的氮含量，并以此表示TVB-N含量，單位為mg/100 g。

采用Hong Hui等[30]的方法測(cè)定TVC，取5 g魚皮樣品，加入50 mL無菌0.90% NaCl溶液，勻質(zhì)器均化30 s，0.9 g/100 mL NaCl（1:10）稀釋一次，取100 μL稀釋樣品均勻涂抹平板計(jì)數(shù)瓊脂上，30 ℃下孵化72 h后計(jì)數(shù)，以lg(CFU/g)表示。

取5 g魚皮經(jīng)勻漿破碎后放入錐形瓶中，加入45 mL無菌蒸餾水，靜置30 min過濾，測(cè)定pH值。

1.3.3.3 感官評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)由9名有經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)定人員組成感官評(píng)定小組，評(píng)估冷藏過程魚皮顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性。本實(shí)驗(yàn)采用Amerine等感官保質(zhì)期9分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[31]，4種指標(biāo)滿分均是9分，每組樣品采樣后，按照顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性進(jìn)行單項(xiàng)評(píng)分，得分為 9表示品質(zhì)優(yōu)，4.0~6.9表示品質(zhì)良好，1.0~3.9表示腐敗。

1.3.3.4 ATP復(fù)合物和K值測(cè)定

采用Huang等[32]的方法提取ATP（三磷酸腺苷）、ADP（二磷酸腺苷）、AMP（磷酸腺苷）、IMP（次黃嘌呤核苷酸）、HxR（肌苷）、Hx（次黃嘌呤），取魚皮1 g，加入2 mL 10%高氯酸溶液（Perchloric acid solution，PCA，濃度0.6 mmol/L和pH 6.4）在勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，4 ℃下5 000 r/min離心3 min后收集上清液，沉淀物再重復(fù)上述操作。所有上清液pH值用1、10 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)整至6.5，4 ℃下5000 r/min離心3 min，隨后上清液用PCA定容至10 mL，-20 ℃保存。采用高效液相色譜儀（內(nèi)置SPD-10A檢測(cè)器和COSMOSIL 5C18-PAQ柱）（4.6 mm I.D.×250 mm），以硼酸緩沖液為pH調(diào)節(jié)劑，以鄰苯二甲醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）為柱前衍生化試劑，磷酸氫二鈉、甲醇、乙腈和水為流動(dòng)相，柱溫40 ℃條件下分離目標(biāo)化合物，分析含量ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx，K值按下式計(jì)算。

K/%=[(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)]×100

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx表示相應(yīng)物質(zhì)的含量/（μmol/g）。

1.3.3.5 生物胺含量測(cè)定

按照采用HPLC分析冷藏過程中生物胺變化。取5 g魚皮，與50 mL蒸餾水勻漿混合，加入10 mL PCA（0.6 mmol/L，pH 6.4），10 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次離心，收集所有上清液，用PCA溶液（0.6 mmol/L，pH 6.4）定容至25 mL，按照J(rèn)ia Shiliang等[33]的高效液相色譜法測(cè)定生物胺含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用采用Origin 9.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和作圖，采用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan’s多組極差法檢驗(yàn)差異性，p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物區(qū)系分析

本實(shí)驗(yàn)基于主坐標(biāo)分析（PCoA）的β-多樣性分析，利用加權(quán)unifrac距離法描述所有樣品的PCoA相似性分析，距離越大表示相似性差。如圖1a菌群相對(duì)豐富度所示，DI組（5 d）、GA組（7 d）、UVC-GA組（8 d）主要受到13類細(xì)菌屬污染。DI0、GA0和UVC-GA0的主要優(yōu)勢(shì)菌屬按從多到少排列順序是Vibrio、Photobacterium和Candidatus-Bacilloplama，DI0組主要優(yōu)勢(shì)菌屬分別占比為 34.81%、28.72%和20.90%，GA0組分別占比為36.11%、26.61%和18.22%，UVC-GA0組分別占比31.51%、17.70%和12.40%。在保質(zhì)期，DI5組的主要優(yōu)勢(shì)菌屬按從多到少排列順序是Pseudoalteromonas、C.Bacilloplama和Litorimicrobium，占總菌群分別為31.31%、21.50%和17.11%，GA7的主要優(yōu)勢(shì)菌屬按從多到少排列順序是Aliivibrio、Pseudoalteromonas和Psychrobater，分別占比為42.40%、20.51%、10.32%。UVC-GA8的主要優(yōu)勢(shì)菌屬按從多到少排列順序是Aliivibrio、C.Bacilloplama和Moritella，分別占比為 29.81%、20.90%、17.62%。貨架期后Vibrio和Photobacterium占比顯著降低，DI5分別為 1.11%和 0.92%，GA7分別為 2.40%和 1.50%，UVC-GA8分別為3.20%和0.80%。UVC-GA8和GA7的C.Bacilloplama分別占比1.51%和0.92%。圖1b所示為微生物區(qū)系組成相似性和差異性。

圖1 冷藏中羅非魚皮菌群相對(duì)豐度(a)和主坐標(biāo)分析(b)Fig.1 Relative abundance of the bacteria (a) and principal co-ordinates analysis (PCoA) (b) of microbiota from tilapia skin during refrigerated storage

本研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚皮在0 ℃冷藏下，UVC-GA組、DI組和GA組在初始貯藏（0 d）的微生物區(qū)系組成變化不大，且相似性相對(duì)高。而貨架期DI5、GA7和UVC-GA 8組的微生物區(qū)系組成發(fā)生明顯改變。微生物在食品表面生長繁殖是導(dǎo)致食品腐敗的主要原因，不同食品表面的微生物區(qū)系變化能導(dǎo)致食品變質(zhì)模式與化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化[11]。Photobacterium是氣調(diào)包裝魚片的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，在冷鮮鮭魚Salmo salar和挪威龍蝦Nephrops norvegicus的Photobacterium繁殖生長最快，是冷藏期產(chǎn)生腐敗胺類和異味的主要誘發(fā)菌[33]。Photobacterium也是魚類產(chǎn)品形成腐胺和尸胺的主要因素，在魚類消化腺內(nèi)繁殖引起腐敗，所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)和胺類擴(kuò)散至體表[34,35]。本研究 0 d時(shí)Photobacterium為第二大優(yōu)勢(shì)菌，但到貨架期該菌未形成優(yōu)勢(shì)菌。C.Bacilloplama也是水產(chǎn)品中重要致腐菌，在0 ℃條件下的生存能力較強(qiáng)，生存pH值范圍較廣[11,36]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有樣品組在冷藏期間均發(fā)現(xiàn)C.Bacilloplama存在，在GA組受到抑制，而UVC-GA組不能抑制該菌生長繁殖，類似結(jié)果也在0 ℃冷藏的P.vannamei[11]、七鰓鰻（Lampetra morii）[36]和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[37]發(fā)現(xiàn)。GA和UVC-GA均能抑制羅非魚皮表面C.Bacilloplama生長，但是 UVC-GA比 GA效果好，可能是該菌對(duì)UVC-GA中生成的醌和活性氧的敏感性比GA較強(qiáng)。UVC-GA組比其它組抑制Pseudoalteromonas和C.Bacilloplama顯著強(qiáng)。說明 UVC-GA 抑制Pseudoalteromonas繁殖生長效果最強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，Pseudoalteromonas是DI5的第一優(yōu)勢(shì)腐敗菌，在UVC-GA8中受到抑制，在GA5成為了第二優(yōu)勢(shì)腐敗菌，說明該菌在羅非魚皮腐敗變質(zhì)起到主要角色，對(duì)UVC-GA敏感而對(duì)GA幾乎不敏感。

2.2 TVC變化

TVC變化檢測(cè)比較相同處理天數(shù)不同處理?xiàng)l件下的顯著性差異，如圖2所示，DI、GA和UVC-GA組的初始TVC分別為1.38、1.38、1.37 log(CFU/g)，隨著冷藏時(shí)間延長，TVC不斷增加。ICMSF[38]提出水產(chǎn)品的 TVC變質(zhì)閾值是 7 log(CFU/g)。第 2 d，UVC-GA組的TVC顯著低于DI組、GA組（p<0.05），GA組顯著低于DI組（p<0.05）。第8 d，UVC-GA組3.16 log(CFU/g)比DI組6.74 log(CFU/g)和GA 組4.52 log(CFU/g)分別顯著減少 3.58、1.36 log(CFU/g)（p<0.05)。DI組的TVC在第5 d為5.37 log(CFU/g)，與Jia等人[29]0 ℃和5 d，5.66 log(CFU/g)和WYSOKA等人[39]0 ℃和5 d，5.24 log(CFU/g)研究結(jié)果相似。DI組、GA組和UVC-GA組的感官評(píng)價(jià)貨架期分別為5 d、7 d和8 d，在第8 d，UVC-GA組的TVC比DI組和GA組顯著減少3.58、1.36 log(CFU/g)（p<0.05）。Cai等人[6]研究發(fā)現(xiàn) UVC-GA抗菌液能使鱸魚Lateolabrax japonicas的TVC減少1.47 log(CFU/g)。Liu等采用 UVC-GA抗菌液處理鳙魚Aristichthys nobilis，使TVC減少1.33 log (CFU/g)[7]。這些結(jié)果表明UVC-GA具有顯著抑菌保鮮效果。

圖2 冷藏中羅非魚皮TVC進(jìn)程變化Fig.2 Progress in TVC of tilapia skin during refrigerated storage

2.3 TVB-N值變化

TVB-N值變化檢測(cè)比較相同處理天數(shù)不同處理?xiàng)l件下的顯著性差異，圖3所示，所有樣品組的TVB-N值在冷藏期間不斷增加，DI組、GA組和UVC-GA組的初始TVB-N值分別為8.10、8.09和8.11 mg N/100 g，自第2 d起，TVB-N值一直是UVC-GA組

圖3 冷藏中羅非魚皮TVB-N進(jìn)程變化Fig.3 Progress in TVB-N of tilapia skin during refrigerated storage

2.4 pH值變化

pH值變化檢測(cè)比較相同處理天數(shù)不同處理?xiàng)l件下的顯著性差異，如圖4所示，DI組、GA組和UVC-GA組的初始pH值無顯著差異，分別是6.81、6.81和6.80。DI組第5 d出現(xiàn)最低pH值，隨后顯著上升。GA組第7 d出現(xiàn)最低pH值，隨后顯著上升。兩組的pH值變化呈V字形，而UVC-GA組的pH值變化呈線性下降趨勢(shì)（6.74~6.88），UVC-GA組的pH先高于GA組和DI組，分別自第5 d和第7 d始低于DI組和GA組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，DI組、GA組和UVC-GA組的pH值分別為8.02、7.81和6.74。相關(guān)文獻(xiàn)稱，pH值大小與冷藏過程中肉質(zhì)表面上微生物增長多少有關(guān)[29]。水產(chǎn)品在貯藏過程中pH值的增加主要是由于蛋白質(zhì)和其他含氮物質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶的作用下分解成揮發(fā)性堿，如胺和三甲胺[40,41]。研究稱，一般食品中pH變化多呈V字形改變，在腐敗開始是略微降低，隨后升高，水產(chǎn)品保持良好品質(zhì)的pH值不超過7.7，新鮮水產(chǎn)品的pH值范圍為6.6~7.8[42]，這與本研究結(jié)果相似。說明UVC-GA能改變羅非魚皮腐敗變質(zhì)，能保持魚皮pH穩(wěn)定在新鮮范圍，而GA和DI效果不佳，可能是 UVC-GA 通過抑制Pseudoalteromonas和C.Bacilloplama等腐敗菌顯著影響羅非魚皮的pH，使pH值保持在新鮮范圍。

圖4 冷藏中羅非魚皮pH進(jìn)程變化Fig.4 Progress in pH value of tilapia skin during refrigerated storage

2.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

食品腐敗主要是腐敗菌滋生造成食品品質(zhì)下降，主要是顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性下降。U細(xì)菌在肉質(zhì)品表面大量繁殖生長過程中產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物導(dǎo)致食品腐敗，引起肉質(zhì)變色、理化性質(zhì)劣變，結(jié)構(gòu)破壞、異味產(chǎn)生，造成感官指標(biāo)下降[29]，如表1所示，隨貯藏時(shí)間的延長，所有樣品感官評(píng)分均顯著下降（p<0.05）。第2 d，與DI組相比，GA組和UVC-GA組在顏色、氣味、組織、可接受性評(píng)分顯著高（p<0.05），GA組與UVC-GA組在顏色、組織、可接受性評(píng)分差異顯著（p<0.05），而在氣味上無顯著差異（p<0.05）。總的來說，DI組和GA組分別自第5、7 d起均處于 1.0~3.9范圍，說明魚皮發(fā)生腐敗，DI組和 GA組的感官評(píng)價(jià)貨架期分別是 5 d和 7 d。UVC-GA組在第8 d各項(xiàng)評(píng)分均大于6，說明魚皮一直處在新鮮狀態(tài)，UVC-GA組的感官評(píng)價(jià)貨架期超過8 d。Pseudoalteromonas是肉質(zhì)的腐敗核心菌屬，能產(chǎn)生大量的硫化物和丙酮，可水解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致質(zhì)地劣化，嚴(yán)重影響肉質(zhì)感官[43]。本研究中，這可能是由于UV-C輻射 GA后產(chǎn)生了醌和活性氧，對(duì)Pseudoalteromonas有較好抑制效果。使得 UVC-GA組的氣味、顏色和質(zhì)地評(píng)分顯著高于DI組和GA組（p<0.05）。

表1 冷藏中羅非魚皮感官評(píng)分Table 1 Sensory scores of tilapia skin during refrigerated storage

2.6 ATP化合物降解變化

圖5為ATP復(fù)合物（IMP、HxR、Hx）和K值變化。如圖所示所有樣品組隨著冷藏時(shí)間延長，IMP和HxR含量先增加后減少，K值和Hx含量不斷增加。各樣品組的HxR含量在實(shí)驗(yàn)初期第0 d沒有顯著差異，DI組和GA組的HxR含量在第4 d達(dá)到最大值（分別是3.63和2.55 μmol/g），而UVC-GA組在第5 d達(dá)到最大值，為0.88 μmol/g。DI組、GA組和UVC-GA組的IMP最大值分別為3.05、4.11和5.43 μmol/g，UVC-GA組的IMP含量顯著高于其它組（p<0.05），說明UVC-GA組能有效抑制IMP降解。此外，自第2 d起，Hx含量隨著貯藏時(shí)間延長而逐漸增加，但UVC-GA組的 Hx含量顯著低于 GA組和 DI組（p<0.05），而UVC-GA組的K值從第2 d起顯著低于其它組（p<0.05）。DI組和GA組的K值分別在自第5 d、第7 d起均大于40%，UVC-GA組第8 d才接近 20%。有研究表明肉質(zhì)的 ATP降解通過“ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx”復(fù)雜轉(zhuǎn)化途徑實(shí)現(xiàn)，并且轉(zhuǎn)化至中間物IMP的途徑為完全自溶過程[29]。本研究中，可能UVC-GA內(nèi)的醌和活性氧阻斷了“IMP→HxR”轉(zhuǎn)化途徑，UVC-GA 組較另兩組更能顯著抑制羅非魚皮的IMP進(jìn)一步降解，避免魚皮口感質(zhì)量下降，新鮮度得以維持。Hx的形成與腐敗菌產(chǎn)生的核苷磷酸化酶有關(guān)[44]。研究稱，IMP在自溶酶和細(xì)菌酶作用下轉(zhuǎn)化為HxR，HxR再轉(zhuǎn)化為Hx，過多的Hx積累使水產(chǎn)品產(chǎn)生苦味[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，自第2 d起，UVC-GA組的Hx顯著低于GA組和HxR，但HxR高于兩組，可能是UVC-GA能顯著抑制腐敗菌群繁殖生長，減少細(xì)菌酶作用于HxR所產(chǎn)生的其降解作用。K值指ATP分解的低級(jí)產(chǎn)物HxR和Hx占ATP系列分解產(chǎn)物的百分比，主要適用于魚類早期腐敗的鑒定，若K≤20%說明魚體絕對(duì)新鮮，K≥40%說明魚體開始有腐敗跡象[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，UVC-GA的K值在第8 d才接近20%，而GA組和DI組分別在第7 d和第5 d均大于40%，進(jìn)一步證實(shí)了UVC-GA抑制ATP降解效果好。此外，魚皮含有大量膠原蛋白，膠原蛋白是具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的生物大分子，比肌肉中其它蛋白抗降解能力高[45]，因此魚皮中ATP降解轉(zhuǎn)化慢可能與魚皮膠原蛋白含量高有關(guān)。

圖5 冷藏中羅非魚皮IMP(a)、 HxR(b)、Hx(c)和 K-值(d)變化Fig.5 Progress in IMP (a), HxR (b), Hx (c), K-value (d) of tilapia skin during refrigerated storage

2.7 腐胺和尸胺含量變化

水產(chǎn)品腐敗產(chǎn)生的生物胺主要是腐胺和尸胺，是一類非揮發(fā)性的低分子量含氮化合物，主要由細(xì)菌脫羧酶作用于游離氨基酸脫羧而形成，均是指示水產(chǎn)品在不同溫度貯藏下的降解指標(biāo)[46]。如表2所示，第0 d時(shí)腐胺含量樣品組中未檢測(cè)，但其含量隨著貯藏時(shí)間增加而增加，DI組、GA組、UVC-GA組在第8 d達(dá)到最大值，分別高達(dá)23.15、10.86和4.96 mg/kg。自第2 d起，UVC-GA組的腐胺其含量顯著低于DI組和UVC-GA組（p<0.05）。第0 d時(shí)尸胺同樣的在所有樣品未檢出，但其含量隨著貯藏時(shí)間增加而增加，尸胺在第8 d DI組、GA組、UVC-GA組的分別達(dá)到18.27、6.46和3.06 mg/kg。UVC-GA組含量均顯著低于GA組和DI組（p<0.05）。表明冷藏過程中魚皮產(chǎn)生腐胺和尸胺被UVC-GA抑制效果最好，可能因?yàn)榧?xì)菌脫羧酶活性或冷藏起始腐敗菌Pseudoalteromonas被UVC-GA內(nèi)的高抗菌物醌和活性氧抑制，增強(qiáng)單用GA的抑菌效果。有研究表明，醌和活性氧能引起細(xì)菌的核酸損傷、蛋白質(zhì)氧化、多糖結(jié)構(gòu)破壞，抑制細(xì)菌生長繁殖[46]。生物胺是氨基酸被多種氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生，篩選脫羧酶抑制劑對(duì)于抑制由水產(chǎn)品腐敗所產(chǎn)生的生物胺具有重要意義[47]。

表2 冷藏中羅非魚皮生物胺變化Table 2 Changes in biogenic amines content of tilapia skin during refrigerated storage

3 結(jié)論

通過對(duì) 0 ℃冷藏的羅非魚皮的微生物區(qū)系、感官指標(biāo)、TVB-N、ATP復(fù)合物、K值、生物胺、TVC研究發(fā)現(xiàn)，在初始貯藏（0 d）時(shí)，魚皮DI組、GA組和UVC-GA組的微生物區(qū)系、TVB-N、ATP復(fù)合物、K值、生物胺、TVC組成變化不大，且相似性極高。而隨著時(shí)間推移，DI組、GA組和UVC-GA組的感官保質(zhì)期發(fā)生改變，綜合評(píng)價(jià)分別為5 d、7 d、8 d。貨架期DI5、GA7和UVC-GA 8組的微生物區(qū)系組成發(fā)生明顯改變。UVC-GA對(duì)Photobacterium和Pseudoalteromonas有較好的抑制作用。UVC-GA組的TVB-N、TVC、腐胺、尸胺、次黃嘌呤核苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）的含量均比較低DI組和GA組低，但5′-單磷酸肌苷（IMP）含量高于其它組；UVC-GA8的K值顯著低于DI 5和GA 7，隨著貯藏時(shí)間延長UVC-GA組的PH值呈下降線性趨勢(shì)，而DI組和GA組則呈“V”形。而通過對(duì)各樣品組的羅非魚皮樣品對(duì)比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DI組相比，UVC-GA組和GA組的羅非魚皮品質(zhì)較好，其中UVC-GA組的品質(zhì)最佳，感官保質(zhì)期最長。羅非魚皮在 0 ℃冷藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌引起品質(zhì)變化的潛在機(jī)制和UVC-GA抑菌機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。