龍曉珊，廖森泰，劉書成，劉凡，黎爾納，龐道睿，穆利霞，王衛(wèi)飛，鄒宇曉

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東省海洋生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088）（3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東茂名 525000）

肉桂，最早作為中藥材記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其又名玉桂、牡桂、玉樹、大桂、辣桂、平安樹、中國桂皮，為樟科樟屬植物，廣泛種植于廣東、廣西、云南、福建、貴州等地，肉桂的干燥樹皮，是著名的藥食兩用植物，具有抗氧化、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤、降低血糖、以及神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[1-6]。

肉桂富含多糖、多酚、揮發(fā)油等活性物質(zhì)，其中，肉桂多酚是肉桂的重要組成成分，主要由類黃酮類、類黃酮多聚體化合物組成，包括兒茶素，表兒茶素，甲基羥基查耳酮，表沒食子兒茶素沒食子酸酯等單體酚[7,8]。現(xiàn)代研究表明，肉桂多酚具有較強(qiáng)的還原性，酚羥基與氧結(jié)合，并清除生物體內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化而保護(hù)機(jī)體的肝腎，具有明顯的抗氧化活性[9-12]。Tulini等表明肉桂酚類物質(zhì)對活性氧簇和活性氮簇自由基具有較強(qiáng)的清除能力，顯示出明顯的抗氧化活性，可以用于開發(fā)新的功能性食品和保健品[13]。而且，肉桂多酚還可以通過干擾多種氧化應(yīng)激和促炎途徑，從而達(dá)到抗氧化的作用[14]。Qin等研究肉桂多酚能夠抑制TNF-α等促炎因子的表達(dá)，增強(qiáng)脫乙酰酶的蛋白質(zhì)水平，提高大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗氧化能力[15]。Li等發(fā)現(xiàn)肉桂多酚通過抑制iNOS和NF-κB等促炎因子的活化來減輕細(xì)胞毒性，提高其抗氧化和降血糖活性[16]。另外，肉桂多酚已被證實(shí)具有顯著的降血糖作用，其作用機(jī)制可能是肉桂多酚可以減輕機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對胰腺β細(xì)胞起到保護(hù)作用，也有可能是其對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，調(diào)節(jié)機(jī)體對葡萄糖的吸收代謝，從而達(dá)到降血糖的目的[17-20]。Panickar等研究發(fā)現(xiàn)肉桂多酚具有抗氧化和胰島素增強(qiáng)作用，緩解細(xì)胞腫脹和炎癥，具有顯著的降血糖作用[21]。Cheng等研究肉桂多酚的降血糖活性，結(jié)果表明肉桂多酚明顯抑制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的基因表達(dá)，減少肝葡萄糖生成，抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低空腹血糖值，同時(shí)改善胰島素的敏感性，從而改善糖尿病[22]。

本研究以肉桂多酚為研究對象，通過測定肉桂多酚對ABTS+、Fe3+、DPPH、OH-等自由基的清除能力以及對α-葡萄糖苷酶的抑制能力，研究肉桂多酚的體外抗氧化和降血糖作用，為肉桂多酚的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂產(chǎn)自廣東省肇慶市高要區(qū)，選取無污染、無病蟲害、外表平整的干燥肉桂，將其粉碎后，過 40目篩，得到顆粒均一的肉桂粉末。

硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸（分析純）購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；維生素C（Vc，分析純）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇（分析純）購自南昌市藍(lán)翔化工有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；福林酚試劑（Folin-Ciocalteau）購自上海荔達(dá)生物科技有限公司；DPPH 購自齊云生物技術(shù)有限公司；2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）二銨鹽、鐵離子還原力（ferric ionreducing antioxidant powe，F(xiàn)RAP）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 series高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Sorvall Stratos高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；Infinite M200PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.3 樣品的制備

精確稱取一定質(zhì)量的肉桂粉，以0.05 g/mL的料液質(zhì)量濃度加入 60%乙醇，超聲輔助提取 60 min，10000 r/min離心10 min后取上清液，濾渣用同樣的方法再次提取，重復(fù)提取3次，合并上清液，將上清液濃縮后凍干成粉末，備用。

1.4 測定方法

1.4.1 肉桂多酚含量的測定

焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精確稱量10 mg焦性沒食子酸，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解后定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成濃度為4、8、12、16、20、24 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液[23]。

測定：采用福林酚比色法，取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品提取物）于 10 mL試管中，先加入 1 mL Folin-Ciocalteau試劑，混合均勻后加入2 mL 10%碳酸鈉溶液，混勻，于25 ℃下避光反應(yīng)60 min后，測定吸光度值（765 nm）。以焦性沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法測定多酚含量。

1.4.2 ABTS+自由基清除能力的測定

采用ABTS試劑盒進(jìn)行測定，于96孔板所有檢測孔中加入200 μL ABTS工作液，空白對照孔中加入10 μL蒸餾水，對照檢測孔加入10 μL梯度濃度的Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL），樣品檢測孔加入10 μL樣品（質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、3、4、5 mg/mL），輕輕混勻；室溫孵育 2~6 min后在734 nm波長處測定其OD值。ABTS+自由基清除率計(jì)算如公式（1）所示

式中：OD樣品為肉桂多酚或Vc吸光度值；OD空白為空白對照孔吸光度值。

1.4.3 亞鐵離子螯合能力的測定

亞鐵離子螯合能力采用FRAP試劑盒測定，于96孔板所有檢測孔中加入180 μL FRAP工作液，空白對照孔中加入5 μL蒸餾水，樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL梯度濃度的樣品（質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、3、4、5 mg/mL），以5 μL梯度濃度的Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）作為陽性對照，輕輕混勻；37 ℃孵育3~5 min后在539 nm波長處測定OD值。亞鐵離子螯合率計(jì)算如式（2）所示。

式中：OD樣品為肉桂多酚或Vc吸光度值；OD空白為空白對照孔吸光度值。

1.4.4 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力參考[24]的方法并加以適當(dāng)改進(jìn)，精確稱取0.004 g DPPH，溶解于無水乙醇后定容至100 mL，保存于棕色瓶中避光保存。配制肉桂多酚樣品，于測定孔加入20 μL樣品和180 μL DPPH；對照孔加入20 μL無水乙醇和180 μL DPPH；空白孔加入200 μL無水乙醇。

測定方法：①檢測組：20 μL梯度濃度肉桂多酚/Vc+180 μL DPPH；②對照組：20 μL 無水乙醇+180 μL DPPH；③空白組：200 μL無水乙醇。

將反應(yīng)液加入酶標(biāo)板中，避光反應(yīng)30 min，在酶標(biāo)儀中測定517 nm波長處的OD值，按式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率，

式中：OD樣品為肉桂多酚或Vc吸光度值；OD空白為空白對照孔吸光度值；OD對照為對照孔吸光度值。

1.4.5 羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率采用Fenton體系測定。分別取6 mmol/L硫酸亞鐵和6 mmol/L過氧化氫各2.5 mL于試管中混勻，加入6 mmol/L水楊酸7.5 mL，充分混勻后將體系放置在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，于510 nm波長處測定吸光度A0，向體系中加入1 mL樣品，37 ℃水浴反應(yīng)15 min，于510 nm波長處測定吸光度Ax；用蒸餾水作空白對照，Vc作陽性對照。羥自由基清除率按式（4）計(jì)算

1.4.6α-葡萄糖苷酶抑制能力的測定

參照[25]并加以改進(jìn)，向96孔板中加入50 μL樣品和25 μL 1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液（用0.1 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液配制），充分混勻后于37 ℃反應(yīng)10 min，加入25 μL 1.5 mol/L對硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷（用0.1 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液配制），充分混勻后于37 ℃反應(yīng)30 min，加入0.2 mol/L碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定OD值，同時(shí)設(shè)定相同體系下的樣品背景對照組（不加酶）、空白對照組（不加樣品）。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（5）計(jì)算，并計(jì)算IC50

式中：OD空白為空白對照組吸光度值；OD樣品為肉桂多酚或阿卡波糖吸光度值；OD背景為樣品背景對照組吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂多酚含量

肉桂多酚由有機(jī)溶劑-水復(fù)合溶劑提取，超聲輔助提取得到，通過福林酚法測定得到肉桂總多酚的含量為64.43 mg/g（干重）。Helal等用福林酚測得肉桂的總酚含量76.6 mg/g（干重）[26]，Helal等用福林酚法測得肉桂多酚的含量為43.8 mg/g（干重）[1]。本文的總酚含量與文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)有一定的差距，但總體是一致的，可能是因?yàn)槿夤鸲喾拥暮颗c肉桂的品種、產(chǎn)地、提取方法、測定方法等都有一定的關(guān)系。楊立鋒等[27]研究不同水果的多酚含量，結(jié)果顯示葡萄、石榴、藍(lán)莓、楊梅、李子、桑椹、黑加侖、山楂的多酚含量分別為 7.1、4.8、8.2、14.8、2.7、19.3、7.9、2.4 mg/g（干重），肉桂的多酚含量顯著高于這些水果的多酚含量。

2.2 肉桂多酚的抗氧化能力

自由基是生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的、對生物體危害較大、毒性較強(qiáng)的一種自由基，會使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性氧簇和活性氮簇自由基，誘發(fā)炎癥的發(fā)生，擾亂機(jī)體的新陳代謝，加速機(jī)體的氧化和衰老[28-30]。肉桂多酚對自由基的清除能力反應(yīng)了其抗氧化能力，清除自由基能力越強(qiáng)，則抗氧化性越強(qiáng)。

2.2.1 ABTS+自由基的清除能力

由圖1可知，隨著肉桂多酚質(zhì)量濃度的增加，其對 ABTS+自由基的清除能力越強(qiáng)，質(zhì)量濃度上升到一定程度時(shí)，ABTS+自由基的抑制率達(dá)到飽和狀態(tài)。當(dāng)肉桂多酚質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對ABTS+自由基的抑制率只有 37.09%，質(zhì)量濃度增加至 3 mg/mL時(shí)，對 ABTS+自由基的抑制率高達(dá) 95.12%，質(zhì)量濃度繼續(xù)增加后，ABTS+自由基的清除率基本上沒有變化。由SPSS軟件計(jì)算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分別為0.71、0.12 mg/mL，對照組Vc對ABTS+自由基的清除能力強(qiáng)于肉桂多酚（p<0.05）。肉桂多酚呈現(xiàn)出較好的抗氧化性，其可能的原因是肉桂多酚是由原花青素、蘆丁、兒茶素、表兒茶素等單體酚組成，這些單體酚具有較強(qiáng)的清除自由基能力。Tulini等[31]發(fā)現(xiàn)肉桂原花青素具有顯著的體外抗氧化和降血糖活性，能有效地清除自由基，降低機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，兒茶素和原花青素等單體酚與 ABTS+自由基反應(yīng)，產(chǎn)生共價(jià)化合物，主要是機(jī)制是 ABTS+自由基的一個(gè)分子從多酚中提取一個(gè)電子（或氫原子），形成半醌自由基，再生母體底物 ABTS。隨后，半醌自由基與 ABTS+自由基的另一分子反應(yīng)，形成第一個(gè)多酚衍生加合物，從而清除生物體內(nèi)的 ABTS+自由基[32]。

圖1 肉桂多酚對ABTS+自由基的清除能力Fig.1 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on ABTS+free radical

2.2.2 亞鐵離子的螯合能力

亞鐵離子螯合能力是指將鐵離子與其他基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)生成螯合物，將鐵離子還原成亞鐵離子，圖2表明，肉桂多酚對亞鐵離子具有較強(qiáng)的螯合能力，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，亞鐵離子螯合能力已經(jīng)達(dá)到63.77%。C D R A M A等研究肉桂酚類物質(zhì)添加入白巧克力，使白巧克力的亞鐵離子螯合能力由 47.6 μg EE/g增加到1060.6 μg EE/g（干重），表現(xiàn)出顯著的抗氧化性[33]，與本文研究結(jié)果一致。同樣地，肉桂多酚對亞鐵離子的螯合能力也存在劑量依賴性，樣品質(zhì)量濃度越大，其亞鐵離子螯合能力越強(qiáng)。由 SPSS軟件計(jì)算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分別為0.27、0.03 mg/mL，對照組Vc對亞鐵離子的螯合能力強(qiáng)于肉桂多酚（p<0.05）。Muhammad等研究肉桂與可可粉混合物的亞鐵離子螯合能力，結(jié)果表明，隨著肉桂比例的增加，其亞鐵離子螯合能力也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)肉桂的比例分別為 0%、25%、50%、75%時(shí)，亞鐵離子的螯合能力分別為 555、878、1131、1323、2389 mmol/L AAE/g DW[34]，這與我們的研究結(jié)果具有相同的趨勢，肉桂多酚對亞鐵離子的螯合能力具有劑量依賴性。文獻(xiàn)報(bào)道，酚酸或羧酸基團(tuán)的共軛堿基本身的負(fù)電荷能夠通過電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)還原絡(luò)合物中的鐵離子，在酚酸中，咖啡酸、原兒茶酸和沒食子酸是最有效的自氧化促進(jìn)劑，在適宜的pH下，會與鐵形成熱力學(xué)穩(wěn)定的螯合物[35]。

圖2 肉桂多酚的亞鐵離子敖合能力Fig.2 The binding ability of cinnamon polyphenols on ferrous ion

2.2.3 DPPH自由基的清除能力

圖3結(jié)果顯示，肉桂多酚對DPPH具有一定的清除能力，同樣存在劑量依賴性，但是與ABTS+清除率和亞鐵離子螯合率相比，肉桂多酚對DPPH的清除能力增長比較緩慢。當(dāng)肉桂多酚質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，DPPH清除率達(dá)到62.64%，質(zhì)量濃度增加為5 mg/mL時(shí)，DPPH清除率僅增加至77.56%，但總體而言，肉桂多酚對DPPH具有良好的清除能力。由SPSS軟件計(jì)算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分別為0.18、0.04 mg/mL，對照組Vc對DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于肉桂多酚。這與文獻(xiàn)的結(jié)果一致，A G S等研究得到肉桂皮清除 DPPH的能力隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，肉桂皮的劑量分別為5、10、15、20、25 μL時(shí)，DPPH清除率分別為71.1%、73.5%、76.2%、82.1%、83.6%[36]。Lin等的研究也表明肉桂清除DPPH的能力隨著肉桂提取物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)[37]。李月等[38]發(fā)現(xiàn)紅毛藻多酚對DPPH自由基有一定清除能力，其IC50值為0.313 mg/mL，清除能力略低于肉桂多酚。萬紅霞等[39]研究廣東東藥食兩用植物的抗氧化作用，結(jié)果顯示高良姜清除DPPH自由基的IC50值為0.058 mg/mL，清除效果強(qiáng)于肉桂多酚，布渣葉清除 DPPH自由基的IC50為0.164 mg/mL，其清除效果和肉桂多酚相當(dāng)，橘紅（0.525 mg/mL）、佛手（0.759 mg/mL）、藿香（0.793 mg/mL）、肉豆蔻（0.964 mg/mL）、陳皮（1.001 mg/mL）、益智仁（1.467 mg/mL）等的清除效果均弱于肉桂多酚（0.18 mg/mL）。

圖3 肉桂多酚對DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on DPPH free radicals

2.2.4 OH-自由基的清除能力

OH-自由基是最強(qiáng)大的活性氧物種（ROS），可氧化蛋白質(zhì)、脂類、DNA和糖類，肉桂多酚含有的酚羥基，可與羥自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而將其清除，達(dá)到清除羥基自由基的效果，減少機(jī)體營養(yǎng)成分的損失[40]。如圖4所示，肉桂多酚的供氫能力較強(qiáng)，有效抑制活性氧簇和活性氮簇的活性，對OH-呈現(xiàn)出良好的清除能力，且隨著樣品濃度的增大，肉桂多酚的清除能力先逐漸增強(qiáng)后趨于平穩(wěn)，存在劑量依賴性。當(dāng)肉桂多酚質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對OH-自由基的抑制率只有48.43%，質(zhì)量濃度增加至5 mg/mL時(shí)，對羥基自由基的抑制率為 78.23%，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，羥基自由基的清除率基本上沒有變化。由 SPSS軟件計(jì)算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分別為0.97、0.045 mg/mL，對照組Vc對OH-自由基的清除能力強(qiáng)于肉桂多酚（p<0.05）。文獻(xiàn)報(bào)道，桑椹清除OH-自由基的IC50為8.13 mg/mL[41]，抑制效果明顯小于肉桂多酚，有可能是桑椹活性成分中巰基、酚羥基的給電能力與肉桂多酚酚羥基相比較弱。

圖4 肉桂多酚對OH-自由基的清除能力Fig.4 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on OH-free radicals

2.3 肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶，可以將機(jī)體攝入的碳水化合物分解成葡萄糖，而α-葡萄糖苷酶抑制劑可以通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，減少葡萄糖的生成，減緩葡萄糖進(jìn)入血液的速度，從而減少餐后血糖升高，穩(wěn)定機(jī)體的血糖值[25,42,43]。另外，這種抑制會減少消化道以及腸道對碳水化合物的吸收，刺激胰島素依賴的葡萄糖攝取，激活A(yù)MPK，并改善大腸內(nèi)的微生物群落，減少炎癥，從而改善糖尿病的癥狀[16,44,45]。

由圖5可知，肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶具有極強(qiáng)的抑制效果，且隨著質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)肉桂多酚質(zhì)量濃度僅為 0.06 mg/mL時(shí)，抑制率已經(jīng)達(dá)到77.02%，體現(xiàn)了較好的抑制效果，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)，抑制率高達(dá)98.29%，幾乎完全能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性。由SPSS軟件計(jì)算得到肉桂多酚和阿卡波糖的IC50值分別為0.048、0.90 mg/mL肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制能力明顯強(qiáng)于對照品阿卡波糖，具有極好的抑制效果。這與A M E等[46]的研究結(jié)果相一致，肉桂多酚α-葡萄糖苷酶的IC50值隨肉桂多酚含量的增加而減少。喬錦莉等[47]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)果忍冬、楊梅、芒果苷對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分別為0.933、1.562、164.16 mg/mL，其IC50值均高于肉桂多酚，說明與藍(lán)果忍冬、楊梅、芒果苷相比，肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶具有更好的抑制效果。

圖5 肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.5 The inhibition of cinnamon polyphenols on α-glucosidase

3 結(jié)論

肉桂多酚含量為64.43 mg/g（干重），對ABTS+、Fe3+、DPPH、OH-等自由基具有明顯的清除能力，存在劑量依賴性，自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而提高。肉桂多酚對以上四種自由基的清除能力由強(qiáng)到弱依次為 DPPH>Fe3+>ABTS+>OH-。肉桂多酚對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制能力，同樣存在劑量依賴性，且抑制效果顯著高于阿卡波糖對照。因此，肉桂多酚具有較強(qiáng)的體外抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制能力。