何澤琪，劉果，闞啟鑫，楊國航，曹庸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

單寧是僅次于木質(zhì)素的第二大類植物多酚，被認(rèn)為是難降解、難消化且對機體有毒害的物質(zhì)[1]。單寧酶作為單寧酸分解技術(shù)相關(guān)的重要酶類，因其安全性較高而被廣泛研究。單寧酶（EC，3.1.1.20）是一種廣泛存在于微生物和植物中的誘導(dǎo)酶，尤其是在以單寧酸為原料的絲狀真菌中可以大量生產(chǎn)[2]。單寧酶的主要特征是它對復(fù)雜的多酚具有活性，如可水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖[3]，還能夠水解復(fù)合型單寧、沒食子酸烷基酯以及綠原酸等物質(zhì)[4]。因此單寧酶已被廣泛應(yīng)用于食品，飲料，釀造，醫(yī)藥，化工等行業(yè)[5]。

目前單寧酶生產(chǎn)的主要方法為微生物發(fā)酵法，對曲霉屬、青霉屬、根霉屬的真菌及乳桿菌等細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的報道較多。液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵是生產(chǎn)單寧酶的兩種主要方式，它們各有利弊：固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的單寧酶主要是胞外酶，具有易回收、酶活高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但不利于均勻調(diào)控；液體發(fā)酵雖代謝參數(shù)易于調(diào)控，但發(fā)酵所得單寧酶酶活不高且回收成本較高[6]。故本研究以液體擴培形成菌絲體，結(jié)合常規(guī)固體發(fā)酵的方式，對黑曲霉進(jìn)行培養(yǎng)。

游離單寧酶在使用過程中存在熱穩(wěn)定性差、使用壽命短、回收重復(fù)利用難等缺點，這極大地限制了單寧酶的工業(yè)運用[7]。常規(guī)的噴霧干燥、冷凍干燥等手段，能使酶延長存儲時間。除此之外，采用有效的固定化技術(shù)制備固定化單寧酶，可以將單寧酶多次循環(huán)使用從而降低單寧酶使用成本，還可以提高單寧酶的理化性質(zhì)及生物穩(wěn)定性[8]，人們將單寧酶固定到載體上來改善其使用性能，常使用的固定化載體有殼聚糖、玉米芯等[9,10]。樹脂材料由于類型多、成本低且具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)，也被用作為酶的固定化載體[10]，且很多已實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。黑曲霉N5-5為本課題組自行篩選和誘變選育的一種單寧酶高產(chǎn)菌株，前期均以小規(guī)模進(jìn)行實驗，研究發(fā)現(xiàn)具有良好的水解沒食子酸丙酯能力[11]。為了黑曲霉 N5-5發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的進(jìn)一步研究與推廣，本研究對酶進(jìn)行擴培，研究其酶學(xué)性質(zhì)，并進(jìn)行純化、干燥、固定化等步驟的試驗，以期為N5-5所產(chǎn)單寧酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

黑曲霉N5-5（保藏號：CCTCC M 2014051）：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省天然活性物食品實驗室-80 ℃凍存；樹脂：購自杭州科創(chuàng)有限公司；麩皮：購自永和飼料廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

UV-VIS紫外分光光度計，日本島津；TUS-200型振蕩型恒溫金屬浴，上海一恒科學(xué)有限公司；DHZ-C型恒溫振蕩器，太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；FD-1PF型立式冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；液相色譜、DHG-970電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊心科學(xué)儀器有限公司；LC-10Avp plus分析型高效液相色譜，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

斜面培養(yǎng)基：取2 g PDA成品培養(yǎng)基，自然pH，定容至50 mL，加熱溶解分裝于試管中，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：稱取單寧酸20 g，蔗糖10 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鐵0.01 g，硫酸鎂0.5 g，定容至 1 L。50 mL每瓶分裝于 200 mL培養(yǎng)瓶中，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：稱取麩皮450 g，硝酸銨5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，磷酸二氫鉀4 g，單寧酸460 g，加蒸餾水500 mL，121 ℃滅菌20 min。

檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液配制：稱取檸檬酸2.10 g和檸檬酸三鈉2.94 g，分別溶解并于100 mL容量瓶中定容，二者濃度均為0.1 mol/L。將檸檬酸與檸檬酸三鈉溶液1:2體積比混合，得檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（下簡稱檸檬酸緩沖液）。

1.2.2 黑曲霉N5-5發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.2.1 液體擴培

參考Jana[12]等的方法，略有修改。將黑曲霉N5-5接種于PDA斜面，30 ℃培養(yǎng)54 h進(jìn)行活化。用15 mL已滅菌的 0.9%生理鹽水將孢子洗下，形成孢子懸浮液。每瓶液體培養(yǎng)基中加入 1 mL孢子懸浮液，置于30 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2.2 固體發(fā)酵

將液體培養(yǎng)所得菌絲體溶液，以100 mL/kg比例加入固體培養(yǎng)基中，翻拌均勻。30 ℃發(fā)酵6 d。

1.2.3 單寧酶酶液制備

1.2.3.1 粗酶液的制備

固體發(fā)酵結(jié)束后，參照張帥[13]等的方法進(jìn)行提酶，略有修改。固體培養(yǎng)基中加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，培養(yǎng)基與緩沖液按質(zhì)量比1:1混合，并充分?jǐn)嚢杞?1 h。得到的混合物先用四層紗布過濾去除大顆粒雜質(zhì)，再用150目濾布過濾，所得濾液即為粗酶液。

1.2.3.2 酶液的純化

將粗酶液用截留分子量為 60 ku的陶瓷膜進(jìn)行過濾濃縮，得到陶瓷膜過濾液和截留液，并檢測理化性質(zhì)及酶活。

1.2.4 單寧酶理化性質(zhì)的研究

1.2.4.1 固形物含量

取潔凈的培養(yǎng)皿，置烘箱內(nèi)105 ℃干燥后冷卻至室溫稱重，重復(fù)此過程至連續(xù)兩次干燥后稱重差異在0.5 mg以下。取 1 mL攪拌均勻的酶液于培養(yǎng)皿中，105 ℃烘箱干燥5 h。5 h后迅速取出放入干燥器中，冷卻至室溫后稱重。同樣重復(fù)此干燥過程至樣品連續(xù)兩次干燥后稱重差異在0.3 mg以下。

1.2.4.2 蛋白含量

采用考馬斯亮藍(lán)法[14]。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，與考馬斯亮藍(lán)G-250試劑作用后，在595 nm波長處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。1 mL樣品溶液按上述步驟操作，蛋白質(zhì)量濃度可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出。得到回歸方程Y=0.0057X，R2=0.9859，可見該曲線擬合良好，可作為樣品中蛋白質(zhì)量濃度計算的方程模型。

1.2.5 酶活的測定

酶解反應(yīng)體系：500 μL酶液+500 μL 10%單寧酸，45 ℃反應(yīng)12或24 h。后以100 ℃，20 min滅活。（另做空白扣除單寧酸自身分解的影響：酶液先以100 ℃加熱20 min滅活，然后迅速冰浴降溫，再加入500 μL的10%單寧酸進(jìn)行反應(yīng)），反應(yīng)一定時間后測定酶活。

1.2.5.1 薄層層析快速檢測酶活

展開劑：甲苯:乙酸乙酯:甲酸=10:18:2；顯色劑：0.1%的氯化鐵溶液（無水乙醇定容）；將硅膠板于105 ℃，活化0.5 h后冷卻至室溫。樣品點樣量為2 μL，于層析缸中展開。展開到3/4高度左右，取出硅膠板，晾干，噴顯色劑或紫外下顯色。

1.2.5.2 高效液相色譜定量檢測

參照張迎杰[15]的檢測方法，略有改動。樣品統(tǒng)一稀釋100倍，過膜后進(jìn)液相檢測；流動相為0.1%磷酸水與甲醇，檢測波長為275 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min；洗脫程序為0~10 min，甲醇濃度10%；10~20 min，甲醇濃度10%~90%；20~25 min，甲醇濃度90%。

1.2.5.3 沒食子酸標(biāo)曲的制作

選取5個濃度的沒食子酸溶液，按2.3.2條件進(jìn)行液相色譜分析。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到回歸方程Y=3×107X-542909，R2=0.995，可見該曲線擬合良好，可作為樣品中蛋白質(zhì)量濃度計算的方程模型。

1.2.6 單寧酶活力的研究

1.2.6.1 酶解能力與底物濃度的探索

將純化后酶液凍干，復(fù)溶后配置成凍干前蛋白濃度，分別與 10%、20%、30%、40%、50%濃度的單寧酸反應(yīng)。檢測方法同2.4。

1.2.6.2 干燥方式對酶活的影響

為考察不同干燥方式對酶活力的影響，本實驗選用噴霧干燥及冷凍干燥兩種方式進(jìn)行試驗。酶的噴霧干燥方法為，使用3 L陶瓷膜截留液，按固形物含量配比20%添加558 g麥芽糊精。使用高壓均質(zhì)機15~20 kPa均質(zhì)后進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥條件為進(jìn)風(fēng)溫度98 ℃，出風(fēng)溫度 50 ℃，霧化器 40 Hz，恒流泵50 r/min。酶的冷凍干燥則使用凍干機-40 ℃冷凍干燥，直至酶液完全凍干。將酶粉分別復(fù)溶至與粗酶液相同蛋白濃度，按方法2.4檢測酶活

1.2.6.3 酶的固定化

將凍干酶粉復(fù)溶成0.1 g/mL，取10 mL加入10 g樹脂，攪拌均勻放入 40 ℃鼓風(fēng)干燥機，后每小時攪拌一次，確保樹脂與酶液混合均勻。測定酶活時取0.5 g固定化酶加入500 μL 10%的單寧酸；另為了測試固定化的穩(wěn)定性及重復(fù)利用率，在反應(yīng)后過濾出樹脂，重復(fù)使用1周測定其活力。

1.2.7 酶活力定義

單位體積粗酶液每分鐘水解底物單寧酸產(chǎn)生 1 μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

各試驗均進(jìn)行3次平行測定，結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用SPSS（IBM SPSS，Armonk，NY）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合以及回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單寧酶的純化

2.1.1 酶液理化性質(zhì)的檢測

對純化前后酶液進(jìn)行研究，為了對其進(jìn)行定量，測定固形物含量及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表1。陶瓷膜截留液固形物含量為 49.34 mg/mL、蛋白含量 1.35 mg/mL，與粗酶液相比兩項指標(biāo)皆增長；而陶瓷膜濾液兩項指標(biāo)較粗酶液均有下降，初步推測所需單寧酶大多于截留液中（表1）。后續(xù)實驗均根據(jù)蛋白含量進(jìn)行統(tǒng)一定量后，對比酶活。

表1 純化前后酶液固形物及蛋白質(zhì)含量對比(mg/mL)Table 1 Comparison of solid content and protein content of enzyme solution before and after purification

2.1.2 薄層色譜層析檢測純化效果

為了測定單寧酶活力及純化效果，將單寧酶粗酶液、單寧酶濾液、單寧酶截留液統(tǒng)一配制成蛋白濃度為0.7 mg/mL的酶液，分別與單寧酸反應(yīng)12 h后，薄層層析檢測結(jié)果圖1。樣品從左至右分別為：10%的單寧酸標(biāo)品，1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)品；滅活粗酶液反應(yīng)體系（空白）；陶瓷膜濾液反應(yīng)體系；陶瓷膜截留液反應(yīng)體系；粗酶液反應(yīng)體系。由圖1可看出，在相同反應(yīng)條件下，過濾液與截留液都能分解單寧酸生成沒食子酸，但截留液比過濾液沒食子酸特征點顏色更深，酶活更高。另外截留液酶解效果比粗酶液更佳，說明用陶瓷膜對粗酶液進(jìn)行純化達(dá)到一定的效果。陶瓷膜截留液的沒食子酸特征點顏色最深，也說明轉(zhuǎn)化生成沒食子酸最多，即單寧酶主要在 60 ku陶瓷膜截留液組分中。這與前期實驗結(jié)果中，黑曲霉N5-5所產(chǎn)單寧酶為分子質(zhì)量64.2 ku的單肽鏈蛋白相符合[16]。

圖1 單寧酶酶活初步檢測薄層層析圖Fig.1 TLC diagram of preliminary detection of tannase activity

單寧酶分子質(zhì)量在 31~320 ku之間，由單個或多個亞基組成[17]，不同來源的單寧酶分子質(zhì)量差異較大。真菌單寧酶均為糖蛋白，存在同源或異源低聚體，有兩個以上亞基[18]，故真菌單寧酶分子質(zhì)量較細(xì)菌單寧酶偏大，在45~320 ku之間[19]。實驗所得結(jié)果與這些結(jié)論一致，故后續(xù)實驗均選擇含有大量單寧酶的陶瓷膜截留液，即純化的酶液，作為研究對象。

2.1.3 HPLC測定純化后酶液活性

金屬浴45 ℃反應(yīng)24 h后，通過HPLC準(zhǔn)確測定酶活。

圖2可看出，陶瓷膜截留液的組分沒食子酸特征峰響應(yīng)值高，通過計算峰面積發(fā)現(xiàn)，純化后蛋白含量為0.7 mg/mL的酶液與10%的單寧酸反應(yīng)24 h，單寧酸分解率可達(dá)到95%以上。

圖2 純化后酶液活性檢測Fig.2 Activity detection of purified enzyme solution

2.2 單寧酶活力的探索

2.2.1 不同干燥方式對單寧酶活性的影響

酶作為生物催化劑，優(yōu)點是具有針對性，效率高等。但缺點是處于游離狀態(tài)的酶對環(huán)境很敏感，如在強酸、強堿、高溫等情況中不穩(wěn)定，酶蛋白變性導(dǎo)致活性降低甚至失活[7]。本研究分別用兩種不同干燥方式干燥單寧酶截留液，使其易于保存。將干燥樣品統(tǒng)一復(fù)溶成與粗酶截留液相同的蛋白濃度 1.35 mg/mL后分別與10%單寧酸反應(yīng)，對其進(jìn)行酶活檢測，具體結(jié)果如圖3。

圖3 不同干燥方式的單寧酶活力對比圖Fig.3 Comparison of tanninase activity of different drying methods

由圖3可知，兩種干燥方式干燥后的酶與單寧酸反應(yīng)后，沒食子酸生成量均較高，單寧酸含量變低，說明不同干燥方式的樣品都具有較好的酶活。通過對比單寧酸減少量發(fā)現(xiàn)，凍干酶比噴干酶反應(yīng)體系的單寧酸特征峰小；另外，凍干酶與未經(jīng)干燥處理的純化酶液都可將10%單寧酸基本反應(yīng)完全，說明凍干對酶液活力影響較小。通過計算酶活，得噴干酶液酶活為174.02 U，而凍干酶液酶活為266.07 U，與純化酶液的酶活相近。對每一處理步驟進(jìn)行固形物、蛋白含量、酶活力等指標(biāo)的測定，總結(jié)如表2。

表2 各步驟蛋白含量及酶活總結(jié)Table 2 Summary of protein content and enzyme activity in each step

此次大批量發(fā)酵所測酶活與實驗室前期小批量發(fā)酵所測酶活471.35 U/mL[13]有差距，分析原因主要有兩個。一是前期使用沒食子酸丙酯作為酶解底物標(biāo)定酶活，而本次為了解決生產(chǎn)實際問題，使用構(gòu)成更為復(fù)雜的單寧酸作為底物，故酶活力定義的標(biāo)準(zhǔn)不同，前期酶活只作為參考值；二是由于發(fā)酵量大，實際發(fā)酵過程中培養(yǎng)基有部分結(jié)團，故對浸提酶液這一步產(chǎn)生影響，酶未能提取完全，后期可采用先機械打散再浸提，或二次浸提的方式改善。

2.2.2 酶活與底物濃度

由上述結(jié)果可知，凍干對酶活影響小，故使用凍干酶探究單寧酸濃度對酶活的影響。將凍干后的純化酶液配置成1.35 mg/mL蛋白濃度分別與10%、20%至50%的單寧酸反應(yīng)（圖4）。根據(jù)單寧酸的減少量可以看出，酶與底物1:1的條件下反應(yīng)24 h，可催化10%、20%的單寧酸完全轉(zhuǎn)化成沒食子酸；對30%濃度的單寧酸，單寧酸幾乎被完全酶解解，但中間產(chǎn)物并未完全轉(zhuǎn)化成沒食子酸；而對于40%、50%的單寧酸，單寧酶酶解大部分單寧酸，但依舊剩下少量單寧酸未被酶解。有研究表明，單寧酶的反應(yīng)速度與底物呈線性關(guān)系，低濃度時表現(xiàn)為一級反應(yīng)；當(dāng)?shù)竭_(dá)一定濃度時，速度增加緩慢并趨于最大值，呈零級反應(yīng)[20]。結(jié)論與本次實驗結(jié)果相似，從30%底物濃度開始，沒食子酸生成量變化不明顯，酶解過程的零級反應(yīng)拐點應(yīng)處于30%附近，即30%單寧酸為合適的底物濃度。

圖4 酶與不同濃度單寧酸反應(yīng)HPLC對比圖Fig.4 HPLC comparison chart of the reaction between enzyme and different concentrations of tannic acid

2.3 固定化酶的循環(huán)使用

為了對固定化酶的效果進(jìn)行更準(zhǔn)確的定性，對其使用時間及重復(fù)使用次數(shù)進(jìn)行探究。每次0.5 g固定化酶與10%單寧酸反應(yīng)24 h，重復(fù)使用6次，使用時長7 d，酶活檢測結(jié)果如圖5。

圖5 固定化酶使用次數(shù)活性檢測圖Fig.5 Activity detection diagram of the number of times the immobilized enzyme is used

由圖5可知，經(jīng)過固定化后的酶，隨時間延長，未被酶解的底物單寧酸含量逐漸增多。循環(huán)使用的前四次單寧酸基本反應(yīng)完全，第5次檢測結(jié)果中單寧酸剩余量明顯增多，酶活降低70%左右。具體酶活變化總結(jié)見表3。固定化酶循環(huán)使用次數(shù)與底物濃度、作用時間和其他反應(yīng)條件有很大關(guān)系，在實際應(yīng)用過程中，根據(jù)生產(chǎn)情況減少底物濃度及作用時間，可增加固定化酶的循環(huán)使用次數(shù)。

表3 固定化酶活力循環(huán)使用次數(shù)與酶活Table 3 Number of cycles of immobilized enzyme activity and enzyme activity

3 結(jié)論

本研究對黑曲霉 N5-5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，提酶后利用膜過濾技術(shù)純化粗酶液，純化后49.34 mg酶液干基含有1.35 mg單寧酶，酶活為258.53 U/mL，比活力為191.57 U/mg，所得單寧酶在1.35 mg/mL蛋白濃度下具有酶解10%至50%濃度單寧酸的能力；對比不同干燥方式對單寧酶活力的影響發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥比噴霧干燥酶活損失少，從保證酶活的角度，可選擇凍干的方式對單寧酶進(jìn)行干燥保存；固定化后的單寧酶在實驗條件下，可重復(fù)使用至少 4次，第5次酶活損失達(dá)70%。本文所提供的單寧酶提取等工藝，為單寧的綠色分解及沒食子酸的綠色生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時固體發(fā)酵所使用的材料利用了人類生產(chǎn)生活中的農(nóng)林業(yè)廢棄物，有利于環(huán)境和能源的可持續(xù)發(fā)展。為了更好地進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用，今后的研究可繼續(xù)從發(fā)酵后酶的提取及固定化兩方面入手，使單寧酶更高效更充分地發(fā)揮作用。