韓江云，陳曉霞，陽麗娟，劉睿涵，楊文婭，張丹

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）（2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000）（3.四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，四川綿陽 621000）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的占位性病變，惡性程度較高，呈易浸潤性生長，預(yù)后不佳，目前發(fā)病率與致死率均是臨床上最高的顱腦腫瘤之一[1,2]。目前，神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病和進(jìn)展的分子機(jī)制尚不完全清楚，但含豐富的新生血管，血管生成能明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。研究證實(shí)VEGF（vascular endothelial growth factor血管內(nèi)皮生長因子）又稱血管通透因子，在正常人腦組織中低表達(dá)，但在Ⅰ~Ⅱ級(jí)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腦組織中異常過度表達(dá)，同時(shí)也高水平表達(dá)于多形性膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤[4]。VEGF-受體（VEGFR）家族主要包括fms樣酪氨酸激酶受體VEGFR-1（fms-like tyrosine，flt-1）、胎兒肝激酶插入?yún)^(qū)受體 VEGFR-2（Kinase insert domain-containing receptor，KDR）及表達(dá)誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR-3（flt-4）等，它們均具有酪氨酸激酶活性[5]。許多研究證實(shí)[6,7]，VEGF/VEGFR 在腦腫瘤微血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如果腫瘤體積超過1~2 mm3，會(huì)不斷釋放VEGF、bFGF（basic fibroblast growth factor，堿性成纖維細(xì)胞生長因子）等血管調(diào)控因子，其中VEGF可與/VEGFR如flt-1、KDR結(jié)合，能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，最終形成腫瘤新生血管，因此，VEGF/VEGFR信號(hào)通路一直是抗腫瘤血管生成重要的分子靶標(biāo)。

近年來，中藥有效部位或成分憑借其毒性低，且具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)等優(yōu)勢，逐漸成為抗腫瘤重要的研究熱點(diǎn)之一[8]。中藥揮發(fā)油是通過超臨界流體萃取或蒸餾等從中藥材中提取的揮發(fā)成分，許多中藥揮發(fā)油具有明顯的抗腫瘤活性，如抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的肉桂、白介子、葡萄柚、洋蔥等植物揮發(fā)油[9,10]。此外，定心藤、檬香茅、樟油、野西瓜等中藥揮發(fā)油，還能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長[11]。作為藥食同源的合江佛手是四川合江道地中藥材，種植面積較大，具有很好的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12,13]。合江佛手揮發(fā)油是西南醫(yī)科大學(xué)張丹課題組采用水蒸氣蒸餾法，從合江佛手中提取的主要有效部位，主要成分檸檬烯和γ-松油烯。研究證實(shí)，檸檬烯具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等活性，γ-松油烯具有抗腫瘤、抗氧化、抗真菌等作用[14]等。本研究采用CCK-8篩選合江佛手揮發(fā)油體外敏感的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)復(fù)制裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞移植瘤模型，觀察合江佛手揮發(fā)油對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長、血管生成指標(biāo)MVD（microvessel density微血管密度）及VEGF、flt-1、KDR蛋白表達(dá)的影響，旨在系統(tǒng)評(píng)價(jià)合江佛手揮發(fā)油的抗腫瘤活性，闡明其抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管生成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

合江佛手：合江佛手購自 GAP認(rèn)證的瀘州合江正海中藥飲片公司，由西南醫(yī)科大學(xué)生藥鑒定教研室稅丕先教授進(jìn)行藥材鑒定。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK8（cell counting kit-8）及PV法兔二抗試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；貝伐單抗注射液（Bevacizumab，Avastin）：Roche公司，批號(hào)：B9387。兔抗鼠VEGF多克隆抗體、兔抗鼠Flt-1、KDR單克隆抗體、CD34單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞株

選擇 4株人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、肺腺癌細(xì)胞（A549）、肝癌細(xì)胞（HepG2），均購自 CCTCC（中國典型培養(yǎng)物保藏中心），采用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，在西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室長期常規(guī)培養(yǎng)、傳代、保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)BALB/c-nu裸鼠55只，5~6 w齡，體重18±2 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（川）2018-24。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，40%~70%的相對(duì)濕度，溫度控制在20~25 ℃，各組祼鼠自由攝食飲水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 合江佛手精油的提取與GC-MS分析

合江佛手精油的提取：合江佛手購自GMP認(rèn)證的瀘州合江正海中藥飲片公司，由西南醫(yī)科大學(xué)稅丕先教授進(jìn)行藥材鑒別。首先冷凍干燥處理，然后粉碎過60目篩（Φ200×50mm）。提取時(shí)準(zhǔn)確稱取合江佛手粉100 g（精確至0.01 g），采用水蒸氣蒸餾法提取。收集含少量水的精油，3000×g離心10 min后脫水處理，最后加入無水硫酸鈉適量制備成合江佛手精油，4 ℃下用棕色密封瓶保存、備用。

合江佛手精油成分分析采用GC-MS處理，得總離子流圖見圖1，定量分析采用峰面積歸一化法。

圖1 合江佛手精油的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of essential oil of volatile oil of Hejiang bergamot

1.4.2 體外抗腫瘤活性篩選

體外實(shí)驗(yàn)選擇4株人腫瘤細(xì)胞（U87、MCF-7、A549、HepG2細(xì)胞），各腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×104/mL，按照每孔90 μL種板，待細(xì)胞貼壁24 h后加藥。合江佛手揮發(fā)油先用吐溫溶解，再用NS稀釋為不同濃度，每孔加入10 μL，最終受試藥物濃度分別為 31.25 μg/mL、62.50 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，各濃度均設(shè) 3 復(fù)孔。陰性對(duì)照加10 μL培養(yǎng)基，陽性對(duì)照為10 μL順鉑。藥物干預(yù)48 h后每孔加入檢測試劑CCK-8 10 μL，孵育1 h后采用酶標(biāo)儀，在450 nm波長下檢測每孔吸光度（A）。以吸光度值計(jì)算增殖抑制率（%），繪制濃度-抑制率曲線，半數(shù)抑制濃度 IC50計(jì)算采用 IC50軟件進(jìn)行。

1.4.3 體內(nèi)對(duì)U87細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇處于指數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，按0.2 mL接種于3只裸鼠右側(cè)皮下，待形成明顯瘤組織后，無菌條件下剪成約1.5 mm3大小的瘤塊，然后分別接種于52只裸鼠右側(cè)腋窩皮下。篩選已形成瘤塊、且瘤徑≥50 mm3的裸鼠，按照隨機(jī)原則分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組（等體積生理鹽水灌胃給藥）、陽性對(duì)照組（貝伐單抗注射液，5 mg/kg腹腔注射給藥）和合江佛手揮發(fā)油低、中、高三個(gè)劑量組（12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg，灌胃給藥）。參考抗腫瘤藥效學(xué)研究指導(dǎo)原則，給藥周期設(shè)為30 d，其中每周給藥5 d，停藥2 d。實(shí)驗(yàn)中每3 d用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量裸鼠移植瘤瘤徑1次，分別計(jì)算3個(gè)腫瘤生長評(píng)價(jià)指標(biāo)：腫瘤體積（TV）、相對(duì)腫瘤體積（RTV）及相對(duì)腫瘤增殖率（T/C %）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，剝?nèi)×鼋M織，稱瘤重。計(jì)算公式如下：

（1）TV（tumor volume）=1/2×a×b2，其中 a、b為祼鼠移植腫瘤的長徑和寬徑；

（2）RTV（relative tumor volume），其中V0為初次給藥時(shí)（d0）所測得的移植瘤體積，Vt為每三天測量的移植瘤體積；

療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]：T/C%（相對(duì)腫瘤增殖率）≤60%且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為有效；如T/C %> 60%則為無效。

1.4.4 裸鼠U87細(xì)胞移植瘤MVD測定

取裸鼠移植瘤組織，依次切片、脫蠟、水化，按免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。CD34單克隆抗體按照1:100稀釋，滴加CD34單抗后4 ℃孵育過夜，滴加二抗。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液代替CD34單抗。采用DAB染色，光鏡下觀察結(jié)果。先在低倍如40倍找到“熱點(diǎn)”（視野下在染成棕色條索狀的血管內(nèi)皮細(xì)胞/血管內(nèi)皮細(xì)胞群，只要與鄰近腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或其它結(jié)締組織細(xì)胞分開，就視為一個(gè)微血管，也就是“熱點(diǎn)”)。然后在200倍視野下，找到祼鼠U87細(xì)胞移植瘤區(qū)域內(nèi)，“熱點(diǎn)”分布最密集的5個(gè)區(qū)域，通過400倍光鏡計(jì)數(shù)選取的5個(gè)區(qū)域，計(jì)算平均值，作為裸鼠U87移植瘤的微血管密度MVD。

1.4.5 Western blot檢測瘤組織中 VEGF、flt-1及KDR的表達(dá)

各組祼鼠U87細(xì)胞移植瘤組織勻漿，經(jīng)組織裂解液裂解后離心提取總蛋白。蛋白含量測定采用BCA法，然后SDS-PAGE膠垂直電脈，轉(zhuǎn)膜、封閉。VEGF、flt-1、KDR及β-actin一抗按照1:1000稀釋，滴加一抗后孵育1 h，再加入PV法兔二抗4 ℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光液（1:1的溶液A和溶液B），完全覆蓋PVDF膜，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影、拍照，蛋白條帶分析采用專業(yè)的Image Lab 3.0與β-actin內(nèi)參比較，計(jì)算祼鼠移植瘤組織中VEGF、flt-1及KDR的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，以p<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析

本研究通過水蒸氣蒸餾法提取合江佛手揮發(fā)油，得率為0.71%；通過GC-MS測定，面積歸一化法計(jì)算其精油中檸檬烯和γ-松油烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為48.46%和35.39%，結(jié)果見圖1。

2.2 體外抗腫瘤活性篩選

選擇4株人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，合江佛手揮發(fā)油干預(yù)后，對(duì)U87、MCF-7、A549、HepG2等腫瘤細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，圖2為合江佛手揮發(fā)油對(duì)各腫瘤細(xì)胞的濃度-增殖抑制率曲線。根據(jù)增殖抑制率，合江佛手揮發(fā)油對(duì) U87、MCF-7、A549、HepG2細(xì)胞的 IC50分別為82.19 μg/mL、173.99 μg/mL、215.83 μg/mL、192.87 μg/mL。

圖2 體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞的濃度-增殖抑制率曲線Fig.2 Concentration-inhibition curve of human tumor cells in vitro (n=3)

佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）屬蕓香科香櫞的變種，因產(chǎn)地不同有川佛手、廣佛手、建佛手、金佛手之分，但中國佛手種植面積以四川最大，其產(chǎn)量也最高[15]。第四次四川中藥資源普查表明，川佛手主要種植區(qū)位于洪雅、夾江、石棉、峨眉、樂山、犍為、沐川、宜賓敘州區(qū)、瀘州合江[16]等岷江流域及長江流域上游的山區(qū)。合江佛手作為藥食同源的四川瀘州道地中藥材，種植面積大，藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取合江佛手的有效部位，得到合江佛手揮發(fā)油，提取得率為0.71%，經(jīng)GC-MS成分分析，主要成分為檸檬烯和γ-松油烯，分別為48.46%、35.39%[17-19]。近年來，有不少關(guān)于佛手揮發(fā)油抗腫瘤研究的報(bào)道，如邵鄰相等研究證實(shí)[20]50 mg/kg的佛手揮發(fā)油對(duì)荷B16黑色素瘤小鼠移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，也有研究報(bào)道[21]，佛手揮發(fā)油灌胃給藥后能明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的增殖，作用機(jī)制與阻滯細(xì)胞周期停留S期、G2/M期，誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，合江佛手揮發(fā)油體外對(duì)4株腫瘤細(xì)胞如U87、MCF-7、A549、HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用，其中敏感性最強(qiáng)的是神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，因此，我們后續(xù)選擇了U87細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 體內(nèi)對(duì)祼鼠U87細(xì)胞移植瘤生長的影響

祼鼠U87細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，合江佛手揮發(fā)油灌胃給藥后，裸鼠 U87細(xì)胞移植瘤的腫瘤體積TV，腫瘤相對(duì)體積RTV和相對(duì)腫瘤增殖率T/C%均緩慢下降，在治療最佳時(shí)間（d24），T/C%分別為65.22%、58.74%、51.36%。由于合江佛手揮發(fā)油中、高劑量組T/C%低于60%，且與對(duì)照組比較p<0.05或p<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示治療有效。結(jié)果見表1、圖3~5。

圖3 對(duì)裸鼠U87細(xì)胞移植瘤RTV的影響Fig.3 Effects on RTV of transplanted U87 cell in nude mice(±S, n=8)

表1 治療最佳時(shí)間（d24）對(duì)裸鼠U87細(xì)胞移植瘤TV，RTV和T/C%的影響Table 1 Effects on TV, RTV and T/C% of transplanted U87 cells in nude mice at the optimal treatment time (d24, ±S)

表1 治療最佳時(shí)間（d24）對(duì)裸鼠U87細(xì)胞移植瘤TV，RTV和T/C%的影響Table 1 Effects on TV, RTV and T/C% of transplanted U87 cells in nude mice at the optimal treatment time (d24, ±S)

注：d0：給藥第0 d（分籠給藥開始），d24：給藥第24 d（實(shí)際療效最佳時(shí)間）；與對(duì)照組比較:*p<0.05，**p<0.01。

組別 劑量/(mg/kg) n TV/mm3 RTV T/C%d0 d24 Control - 6 123.49±13.62 1026.45±97.24 8.91±0.65 100 Bevacizumab 5 6 117.18±12.55 489.76±56.27** 3.87±0.29** 43.42 VO-HB 5 6 119.42±14.54 823.42±71.22* 5.81±0.37* 65.22 VO-HB 10 6 124.72±13.41 687.35±65.43** 5.23±0.35** 58.74 VO-HB 20 6 121.77±12.95 575.26±59.47** 4.57±0.39** 51.36

圖4 對(duì)裸鼠U87細(xì)胞移植瘤T/C%的影響Fig.4 Effects on T/C% of transplanted U87 cell line in nude mice (±S, n=8)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚葉組織的惡性腫瘤，由于人類生存環(huán)境的不斷惡化，我國神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病率與致死率呈現(xiàn)明顯的逐年升高趨勢。2019年中國分地區(qū)腫瘤分布數(shù)據(jù)顯示[22]，神經(jīng)膠質(zhì)瘤年發(fā)病率已達(dá)到5~8人/10萬人，而五年生存率不足10%，僅次于肺癌和胰腺癌，為預(yù)后較差的惡性腫瘤之一。目前，我國神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在早期發(fā)現(xiàn)較難的問題，多數(shù)患者診斷明確時(shí)已經(jīng)失去早期手術(shù)機(jī)會(huì)，而化學(xué)治療又存在毒副作用較大，不易穿透血腦屏障，且易產(chǎn)生多藥耐藥性等問題，因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤難以取得理想的臨床效果。研究發(fā)現(xiàn)[23]，配合使用一些小分子靶向藥物及中藥復(fù)方，特別是中藥有效部位或成分，可適當(dāng)減少膠質(zhì)瘤術(shù)后的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，也能延長腫瘤患者的中位生存時(shí)間?？鼓[瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則指出，體內(nèi)抗腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：T/C%（相對(duì)腫瘤增殖率）≤60%且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為有效。合江佛手揮發(fā)油25、50 mg/kg治療組的T/C%均小于60%，且有一定的劑量依賴關(guān)系，揭示合江佛手揮發(fā)油體內(nèi)也有較強(qiáng)的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性，具有較好的開發(fā)前景，有希望用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床的輔助治療。

圖5 治療結(jié)束時(shí)對(duì)裸鼠U87細(xì)胞移植瘤瘤重的影響Fig.5 Effects on weight tumor of transplanted U87 cell line in nude mice at the end of treatment (±S, n=6)

2.4 對(duì)瘤組織中 MVD 及 VEGF、flt-1、KDR表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果表明，對(duì)照組祼鼠瘤組織呈明顯的棕褐色索狀，“熱點(diǎn)”分布較多。貝伐單抗陽性組與合江佛手揮發(fā)油三個(gè)治療組裸鼠瘤組織，“熱點(diǎn)”稀疏分布，MVD值由對(duì)照組的63.24分別降低到30.65、46.88、40.18、36.56，與對(duì)照組比較p<0.05或p<0.01，結(jié)果圖6。Western blot檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組瘤組織中有大量的VEGF、Flt-1及KDR蛋白表達(dá)，貝伐單抗陽性組與合江佛手揮發(fā)油三個(gè)治療組減少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相對(duì)表達(dá)，與對(duì)照組比較，蛋白相對(duì)表達(dá)VEGF由對(duì)照組的0.93分別降低到0.19、0.52、0.33、0.16，flt-1由對(duì)照組的0.82分別降低到0.18、0.50、0.32、0.09，KDR由對(duì)照組的0.78分別降低到0.14、0.48、0.30、0.11，p<0.01。結(jié)果見圖7。

圖6 對(duì)U87細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中微血管密度的影響（×200）Fig.6 Effect on MVD in transplanted U87 cells in nude mice(×200)

圖7 U87細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中VEGF，flt-1和KDR的蛋白相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of VEGF, Flt-1, and KDR protein in transplanted U87cells in nude mice

研究證實(shí)，缺氧耐受是腫瘤新生血管生成的啟動(dòng)信號(hào)，也是惡性腫瘤血管增殖、遷移及小管形成的關(guān)鍵促進(jìn)因素。HIF-1（hypoxia-inducible factor-1，低氧誘導(dǎo)因子-1）是重要的血管生成調(diào)控的上游因子，參與了多種惡性腫瘤的血管生成以及其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[24]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特征與其他惡性腫瘤相似，當(dāng)營養(yǎng)需求不能被滿足導(dǎo)致惡性腫瘤局部缺血、缺氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞HIF-1基因被大量激活，直接激活血管內(nèi)皮生長因子及其受體（VEGF/VEGFR)，從而起到促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和小管形成，形成新生血管。VEGF-165在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中優(yōu)勢表達(dá)，是VEGF主要存在構(gòu)型，當(dāng)VEGF與VEGFR結(jié)合后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，充分發(fā)揮生物學(xué)功能促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管生成。迄今為止，VEGFR的5種異構(gòu)受體已經(jīng)被確認(rèn)：VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）、VEGFR-3、NP-1和NP-2。Wojtukiewicz MZ等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lk-1受體是VEGF促進(jìn)血管生成的先決條件，而應(yīng)用VEGFR-2單克隆抗體如貝伐單抗，則可通過拮抗VEGF、bFGF導(dǎo)致的腫瘤血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)[26,27]腫瘤組織微血管密度（MVD）作為腫瘤血管生成間接評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，與惡性腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤預(yù)后密切有關(guān)。隨著合江佛手揮發(fā)油劑量的增加，裸鼠U87移植瘤組織棕褐色條索狀分布較少，“熱點(diǎn)”稀疏，MVD值明顯降低。Western blot檢測結(jié)果表明，合江佛手揮發(fā)油隨著藥物濃度的增高而減少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相對(duì)表達(dá)，揭示抑制VEGF/VEGFR信號(hào)通路可能是其抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤血管生成的重要分子機(jī)制之一。

3 結(jié)論

3.1 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合江佛手揮發(fā)油對(duì) U87、MCF-7、A549、HepG2細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞作用最敏感。由于合江佛手揮發(fā)油體外抗腫瘤具有一定的選擇性，因此，我們后續(xù)選擇了U87細(xì)胞進(jìn)行祼鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 祼鼠U87細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，合江佛手揮發(fā)油三個(gè)治療組裸鼠U87細(xì)胞移植瘤三個(gè)腫瘤生長的評(píng)價(jià)指標(biāo)TV、RTV和T/C%明顯下降，治療最佳時(shí)間（d24）T/C%分別為65.22%、58.74%、51.36%。25、50 mg/kg治療組的T/C%低于60%且與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，揭示合江佛手揮發(fā)油體內(nèi)抗腫瘤為有效，具有較好的開發(fā)前景，有望臨床用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的輔助治療。

3.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多血管的惡性腫瘤，其生長、轉(zhuǎn)移離不開腫瘤血管的生成。腫瘤血管生成與多種血管調(diào)控因子如VEGF、bFGF、PFDF等密切相關(guān)。合江佛手揮發(fā)油隨著藥物濃度的增高而減少VEGF、flt-1及KDR蛋白的相對(duì)表達(dá)，具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤血管生成的作用。綜上所述，合江佛手揮發(fā)油體內(nèi)抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子機(jī)制可能與靶向抑制 VEGF/VEGFR信號(hào)通路，抗腫瘤新生血管生成有關(guān)。