祁新，戴天浥,3，趙紅梅，田洋,3，白忠彬

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）（2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201）（3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201）

目前，惡性腫瘤的年發(fā)病率在繼續(xù)增加，并且成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。化療是惡性腫瘤患者主要的治療方式，常見的化療藥物以5-FU、伊立替康、甲氨蝶呤等最為常見[2]。但是，這些化療藥物不僅能殺傷腫瘤細(xì)胞，也對機(jī)體細(xì)胞造成了極大損害[3]。據(jù)報(bào)道，50%~80%的癌癥患者在化療過程中患有腸道黏膜炎，其主要發(fā)生在小腸部位，臨床表現(xiàn)為體重減輕，腸道隱窩細(xì)胞凋亡，腸道細(xì)胞炎性浸潤，破壞腸道屏障，腸黏膜通透性增高而影響腸道微生態(tài)平衡，這大大限制了化療藥物在臨床上的應(yīng)用[4]。研究表明腸道黏膜炎的發(fā)展可能與促炎因子如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-1β水平的上升有密切關(guān)系[5]。到目前為止，化療性腸道黏膜炎的致病因素和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，醫(yī)學(xué)上還沒有可以完全治愈該疾病的方法。

目前，臨床常用氫氧化鋁、堿式碳酸鉍、鹽酸阿扎司瓊、格拉司瓊等藥物改善或控制化療藥物引起的胃腸道毒性反應(yīng)，這些藥物雖然在臨床實(shí)踐中有一定的作用，但是可引起機(jī)體發(fā)生過敏、呼吸、心血管系統(tǒng)損傷等一系列不良反應(yīng)，這使腫瘤患者不得不停止化療進(jìn)程[6]。因此，尋找一種天然藥食兩用的中藥材治療和預(yù)防化療性腸道黏膜炎已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。

三七為五加科人參屬植物，主產(chǎn)于云南文山州，在廣西、廣東、福建等地也有分布[7]。三七葉具有抗炎[8]、抗氧化[9]、保肝利膽[10]、抗血栓[11]等作用，其主要生物活性成分為人參皂苷類、多糖、黃酮[12]等，此外，近年來國內(nèi)外學(xué)者就三七葉的抗炎，免疫調(diào)節(jié)活性做了廣泛的研究，研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的raw264.7巨噬細(xì)胞模型中，以濃度依賴的方式顯著降低TNF-α、IL-6、iNOS的分泌，且無細(xì)胞毒性[8]，三七多糖在小鼠足腫脹模型中，可以抑制血清TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，具有抗炎作用[13]，三七黃酮具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[14]。但目前國內(nèi)還沒有三七葉干預(yù)化療藥物誘導(dǎo)腸道黏膜炎的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)將初步探究三七葉水提物對化療藥物所致腸道損傷的干預(yù)作用，采用5-FU建立動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性昆明鼠40只，6~8周齡，體重20~25 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：211002300046930，許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：23~25 ℃，相對濕度60%~65%，光照12 h，自由進(jìn)食、飲水。所有程序均嚴(yán)格按照中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理法規(guī)以及云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制定的指南進(jìn)行，并經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

三七葉，云南省普洱市瀾滄縣有機(jī)三七種植示范基地；5-FU(CAS:51-21-8)，上海源葉生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料，南京諾唯贊生物科技有限公司；抗體（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），Abcam公司；引物IL-1β、IL-6、TNF-α、MUC-2、ZO-1、Occludin，上海捷瑞生物工程有限公司；免疫組化試劑盒，Vector公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-1冷凍干燥機(jī)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；LightCycler480 II熒光定量PCR儀，德國Roche公司；光學(xué)生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；組織包埋機(jī)、脫水機(jī)與切片機(jī)，賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三七葉水提物的制備

三七葉水提物的制備參考何小芳[15]，在此基礎(chǔ)進(jìn)一步加以改進(jìn)，將三七葉進(jìn)行粉碎，過60目篩，取適量三七葉粉，加入20倍重量的蒸餾水，煮沸30 min，過濾，得到濾渣重復(fù)上面操作，合并濾液，冷卻室溫，于4000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥條件為進(jìn)口溫度175 ℃，出口溫度105 ℃，進(jìn)樣量500 mL，裝袋于常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?，稱重測得提取率為 30.2%，測得三七葉水提物中總皂苷的含量為73.36 mg/g，總糖含量為302.24 mg/g，總黃酮含量為10.38 mg/g。

1.3.2 動(dòng)物試驗(yàn)分組、給藥與模型建立

昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將小鼠按體重隨機(jī)分成對照組，模型組，三七葉水提物低、中、高劑量組。正常組灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水，每日1次，持續(xù)14 d，24 h后腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)2 d；模型組灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水，每日1次，持續(xù)14 d，24 h后腹腔注射5-FU（130 mg/kg，溶于生理鹽水），每日1次，持續(xù)2 d；根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定三七葉水提物劑量，三七葉水提物低、中、高組（50、100、200 mg/kg，溶于蒸餾水），每日1次，持續(xù)14 d，24 h后腹腔注射5-FU（130 mg/kg，溶于生理鹽水），每日1次，持續(xù)2 d。并記錄小鼠每日體重，各組小鼠于腹腔注射結(jié)束后48 h處死。

1.3.3 動(dòng)物組織收集

頸椎脫臼處死小鼠，剖開腹腔進(jìn)行組織收集，收集近盲端空腸段1 cm，用PBS沖洗干凈液氮速凍后于-80 ℃保存。收集近胃端空腸段1 cm，用PBS沖洗干凈放入4%多聚甲醛固定（4 ℃）固定。

1.3.4 小腸組織形態(tài)學(xué)檢測

將放入4%多聚甲醛固定的空腸進(jìn)行沖水3 h后使用濃度遞增的酒精脫水，酒精濃度依次為45%、55%、65%、75%、85%、95%、無水酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。對石蠟包埋塊切片，厚度為5 μm，切片后再使用濃度遞減酒精水化，酒精濃度依次為無水酒精、95%、85%、75%、65%，洗后進(jìn)行 H&E（hematoxylin andeosin）染色。電子顯微鏡下觀察各組小鼠空腸組織形態(tài)學(xué)變化并在100倍下采集圖片，在軟件Image-pro plus 6.0下進(jìn)行測量。

1.3.5 小腸增殖蛋白免疫組化染色

石蠟包埋，切片厚度5 μm，在烘箱65 ℃烤片60 min，濃度遞減酒精水化，采用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，加入10%過氧化氫室溫下孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次×5 min，5%牛血清蛋白進(jìn)行封閉，滴加PCNA單克隆抗體4 ℃過夜。第二天回收一抗，PBS洗滌3次×5 min，加入HRP標(biāo)記的PCNA蛋白二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次×3 min，加入DAB后，UP沖洗和蘇木精復(fù)染1 min，脫水后進(jìn)行封片，在烘箱65 ℃烤片60 min，在顯微鏡400倍下進(jìn)行觀察并采集圖像。

1.3.6 熒光定量PCR法檢測小腸屏障、炎癥因子mRNA表達(dá)水平

將-80 ℃凍存的小腸組織進(jìn)行總RNA提取，用分光光度計(jì)測定RNA的濃度。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測，采用SYBR Green Master (Rox)(Roche)按照表1進(jìn)行上機(jī)操作，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列見表2。

表1 RT-PCR擴(kuò)增條件Table 1 RT-PCR Amplification conditions

表2 RT-PCR引物序列Table 2 RT-PCR primer sequence

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析和獨(dú)立t檢驗(yàn)，*表示p<0.05，差異顯著，**表示p<0.01，差異更為顯著，***表示p<0.001差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠體重變化的影響

體重減輕是化療性腸道炎一個(gè)重要的臨床指標(biāo)，嚴(yán)重影響化療患者的生存質(zhì)量[16]。如圖1a所示，小鼠灌胃三七葉水提物14 d后，各組小鼠體重變化沒有差異。從模型建立開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組小鼠體重變化發(fā)生改變。如圖1b所示，與對照組相比，模型組小鼠體重顯著降低284.50%（p<0.001）。與模型組相比，三七葉水提物低、中、高劑量組體重分別增加26.89%、26.72%、49.24%（p<0.05），低、中劑量差異不顯著。結(jié)果表明，5-FU誘導(dǎo)小鼠化療性腸道黏膜炎后，小鼠體重顯著降低，然而三七葉水提物可以逆轉(zhuǎn)由 5-FU造成的小鼠體重的減輕。有研究表明，化療引起的小鼠體重下降可能與腸道組織無法對食物進(jìn)行吸收消化以及腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂有關(guān)[17,18]。

圖1 三七葉水提物對化療性腸道黏膜炎小鼠體重變化的影響Fig.1 Effect of Panax notoginseng leaf extract on weight change of mice with chemotherapy-induced intestinal mucositis

2.2 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響

小腸是消化和吸收的主要場所，也是最主要的吸收器官，這與小腸絨毛長度和隱窩深度有密切的關(guān)系。小腸絨毛上皮細(xì)胞將消化道中的氨基酸、葡萄糖、無機(jī)鹽等吸收進(jìn)血液，如果此部位受損，將影響上述營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，腸隱窩深度代表細(xì)胞的生成率，隱窩越淺細(xì)胞成熟度越好，分泌功能越好。絨毛縮短、隱窩深度增加、絨毛長度/隱窩深度比值下降都反映小腸黏膜損傷嚴(yán)重程度[19]。如圖2所示，對照組小鼠小腸絨毛形態(tài)整齊規(guī)則，模型組絨毛形態(tài)萎縮、隱窩結(jié)構(gòu)喪失，損傷較嚴(yán)重，三七葉水提物給藥組絨毛萎縮、隱窩結(jié)構(gòu)缺失情況減少，較模型組有所改善，高劑量組小腸組織結(jié)構(gòu)與正常組小腸組織結(jié)構(gòu)相接近。

圖2 各組小鼠小腸組織切片（HE染色，×100）Fig.2 Sections of small intestine in each group (HE staining,×100)

如圖3a、b、c所示，與對照組比較，模型組小腸組織絨毛高度值顯著降低38.26%（p<0.001）、隱窩深度顯著增加56.96%（p<0.001）、小腸絨毛高度值與隱窩深度比值顯著降低59.79%（p<0.001），這表明化療性腸道黏膜炎動(dòng)物模型建立成功[20]。與模型組比較，三七葉水提物低、中、高劑量組小腸絨毛高度值分別增加 12.25%（p<0.05）、18.57%（p<0.01）、22.92%（p<0.01）。隱窩深度值分別降低 5.71%、8.42%、16.27%（p<0.05），低劑量和中劑量差異不顯著。小腸絨毛高度與隱窩深度的比值分別增加16.92%、24.8%（p<0.05）、42.32%（p<0.001），低劑量差異不顯著，這可能與三七葉中生物活性成分多糖有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道植物多糖可以明顯改善 5-FU引起的組織形態(tài)學(xué)變化[5]。這就表明三七葉水提物能夠有效緩解腸道黏膜炎小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)的變化，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 三七葉水提物對化療性腸道黏膜炎小鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.3 Effect of Panax notoginseng leaves extract on intestinal histomorphology in mice with chemotherapy-induced intestinal mucositis

2.3 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織PCNA蛋白表達(dá)的影響

目前研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物可直接損傷腸黏膜上皮細(xì)胞，引起腸上皮細(xì)胞損傷、凋亡；影響細(xì)胞增殖，阻礙腸黏膜修復(fù)[21]，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，PCNA是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[22]。本研究采用免疫組織化學(xué)法對小腸PCNA蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。如圖4所示，與對照組相比，模型組PCNA蛋白表達(dá)量顯著降低36.48%（p<0.001），說明模型組腸道隱窩細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞增殖能力大大減弱。與模型組相比，三七葉水提物低、中、高劑量組PCNA蛋白表達(dá)量分別增加3.08%、21.02%（p<0.05）、21.54%（p<0.05），但低劑量沒有顯著性差異，這與 DongWenqin等[23]研究結(jié)果一致。結(jié)果表明，三七葉水提物可以促進(jìn)化療性腸道黏膜炎小鼠小腸細(xì)胞增殖，從而緩解化療引起的小鼠腸道黏膜炎。

圖4 三七葉水提物對化療性腸道黏膜炎小鼠小腸PCNA蛋白表達(dá)的影響（IHC染色，×400）Fig.4 Effect of Panax notoginseng leaf extract on expression of PCNA protein in small intestine of mice with chemotherapy-induced intestinal mucositis (IHC staining,×400)

2.4 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織MUC-2、ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)的影響

腸道黏膜屏障主要由上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，是阻礙大分子有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的重要屏障[24]，化療性腸道黏膜炎會(huì)破壞腸粘膜屏障，導(dǎo)致功能的喪失，腸道屏障標(biāo)志物MUC-2、ZO-1、Occludin可反應(yīng)腸道屏障功能的完整性[25]。如圖5a~c所示，與對照組相比，模型組MUC-2、ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量分別顯著降低65.52%（p<0.01）、70.07%（p<0.01）、76.05%（p<0.001），證明受化療藥物影響，腸道屏障嚴(yán)重受損。與模型組相比，三七葉低劑量組MUC-2、ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量分別增加 84.67%、115.17%（p<0.05）、91.73%，MUC-2與OccludinmRNA表達(dá)量差異不顯著。三七葉中劑量組MUC-2、ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量分別增加 100.63%、170.61%（p<0.05）、115.24（p<0.05），MUC-2mRNA 表達(dá)量差異不顯著。三七葉高劑量組MUC-2、ZO-1、OccludinmRNA 表達(dá)量分別增加 157.66%（p<0.05）、167.73%（p<0.01）、212.14（p<0.05）。這與de Barros P A V等[4]研究結(jié)果一致。研究表明，三七葉水提物對化療性腸道黏膜炎小鼠小腸屏障具有一定的保護(hù)作用。

圖5 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織MUC-2、ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Panax notoginseng leaf extract on the expression of MUC-2, ZO-1 and Occludin mRNA in small intestine of mice with intestinal mucositis

2.5 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)胞凋亡可促進(jìn)腸細(xì)胞炎癥因子的分泌，在腸道黏膜炎病變過程中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α起著十分重要的作用，大量炎癥因子的分泌會(huì)導(dǎo)致腸粘膜功能紊亂，炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)是衡量腸道黏膜損傷的嚴(yán)重程度和修復(fù)重要指標(biāo)[26]。如圖6a、b、c所示，與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表達(dá)分別增加 128.29%（p<0.001）、160.71%（p<0.05）、58.84%（p<0.01）。說明化療藥物可增加腸道炎癥因子的表達(dá)，腸道嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比，三七葉水提物低劑量IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)分別下降15.72%、28.57%、25.52%，沒有顯著性差異。三七葉水提物中劑量IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表達(dá)分別下降32.61%（p<0.05）、34.33%、45.05%（p<0.05），IL-6mRNA表達(dá)差異不顯著。三七葉水提物高劑量IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)分別下降 34.24%、35.18%、33.52%（p<0.05），IL-1β與IL-6mRNA表達(dá)差異不顯著。研究表明，三七葉水提物可抑制腸道黏膜炎小鼠小腸炎癥因子的表達(dá)。這與Bi Xiuli等[27]研究結(jié)果一致，三七葉水提物具有抗炎活性。

圖6 三七葉水提物對腸道黏膜炎小鼠小腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Panax notoginseng leaves extract on the expression of IL-1 β, IL-6 and TNF-α mRNA in small intestine of mice with intestinal mucositis

3 結(jié)論

綜上所述，在5-FU誘導(dǎo)腸道黏膜炎模型中，三七葉水提物可以逆轉(zhuǎn)小鼠體重下降、維持小腸組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、促進(jìn)小腸隱窩細(xì)胞增殖、保護(hù)腸道屏障、抑制腸道炎癥因子表達(dá)，表明三七葉水提物可以有效地預(yù)防化療性腸道黏膜炎。但是具體的作用機(jī)制還不清楚，有待于更進(jìn)一步研究，也為三七的綜合開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。