尹馨雪，蘭夢，郅慧，張輝，李晶峰

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117）（2.吉林省東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130000）

心力衰竭（Heart Fialure，HF）是嚴(yán)重危害人類健康的一種病理綜合征，與惡性腫瘤病人死亡率相仿，見于各種心血管疾病。近年來，隨著心血管疾病患者的增多、社會醫(yī)療水平的提高以及全球老齡化，心力衰竭人數(shù)的不斷增多已成為重要社會公眾衛(wèi)生問題[1]。心肌細(xì)胞損傷凋亡及過度分泌炎癥因子是導(dǎo)致心力衰竭的重要因素。因此抑制心肌細(xì)胞損傷凋亡及其產(chǎn)生的炎癥因子對于心力衰竭的防治具有積極的意義[2]。

鹿血是梅花鹿（Cervus nipportTemminck）或馬鹿（Cervus elaphusLinnaeus）的膛血或茸血，系傳統(tǒng)的名貴中藥。近年來，鹿血產(chǎn)品的研發(fā)受到廣泛關(guān)注，目前鹿血產(chǎn)品主要形式為鹿血酒、鹿血口服液、鹿血口嚼片、鹿血滋補(bǔ)膠囊[3]，作為特色藥食同源食品，市面上也出現(xiàn)了鹿血蛋羹、鹿血粥等產(chǎn)品[4]。鹿血中的主要成分是蛋白質(zhì)，含量占13%以上，蛋白質(zhì)是由肽組成的[5]，鹿血肽是指鹿血中的蛋白質(zhì)被蛋白酶水解產(chǎn)生的多肽，活性較好，具有特殊的生物學(xué)功能,比蛋白質(zhì)更易被人體吸收[6]。現(xiàn)代臨床研究表明，鹿血肽在補(bǔ)血、強(qiáng)心、抗氧化、提高免疫力、抗衰老等方面有顯著療效[7]。姜紅等[8]通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鹿茸血水解肽能明顯提高小鼠脾臟、胸腺指數(shù)，同時，能極顯著地提高小鼠血清總抗氧化能力，證明了鹿茸血水解肽能有效的提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力；付彩霞等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹿血酶解液可提高模型小鼠的血清活力、降低肝臟中的丙二醛（MDA）含量和抑制單胺氧化酶B（MAO-B）的活力，從而證明鹿血酶解液具有抗衰老作用；王博[10]等人通過采用鹿血灌流離體心臟方法，觀察鹿血對離體心臟的直接效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)鹿血可明顯增強(qiáng)離體牛蛙心臟的心肌收縮力，證明了鹿血具有增強(qiáng)心肌收縮力的作用，進(jìn)一步反映了鹿血對心臟的強(qiáng)心作用。

鹿血在治療心力衰竭方面的相關(guān)文獻(xiàn)較少，現(xiàn)有研究表明，鹿血的低膽固醇含量，以及其中的各種酶對心血管疾病具有一定的治療作用[10]。本研究選用超濾技術(shù)將鹿茸血酶解肽分成不同的分子量，采用 LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，通過考察其對損傷后H9c2細(xì)胞增殖抑制活性的影響，篩選鹿茸血酶解肽對LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的活性組分，以及最佳組分對H9c2細(xì)胞分泌炎癥因子的影響，在細(xì)胞水平上探討鹿茸血酶解肽對LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，對鹿血的開發(fā)及應(yīng)用有顯著意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿茸血，通化承誠藥業(yè)有限公司；堿性蛋白酶，上海寶曼生物科技有限公司；大鼠心肌細(xì)胞（H9c2），廣州賽庫生物技術(shù)有限公司；卡托普利，上海源葉生物科技有限公司；脂多糖LPS，索寶來公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），美國Amresco公司；胎牛血清，美國Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒，長春百金生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

GZLY-0.4藥用真空冷凍干燥機(jī)，北京速原中天科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州市英峪予華儀器有限公司；680型酶標(biāo)儀，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；L-8900型氨基酸自動分析儀，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿茸血酶解肽的制備

取一定量用紗布過濾好的新鮮鹿茸血，按底物濃度5%加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為10.4，按4400 U/g加入一定量的堿性蛋白酶，52 ℃下酶解5 h，反應(yīng)過程中不斷加入1 mol/L NaOH或HCl維持pH恒定在10.4，水解反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶30 min，迅速冷卻，水解液3800 r/min離心30 min[8]收集上清液冷凍干燥，得到鹿茸血酶解肽凍干粉（DBP）備用。

1.2.2 超濾膜分級不同分子量

2.1 2012-2016年剖宮產(chǎn)率變化 2012-2016年本院分娩的孕產(chǎn)婦總數(shù)為8 729例，其中剖宮產(chǎn)3 000例，剖宮產(chǎn)率為34.37%。2012-2016年剖宮產(chǎn)率在28.03%～41.62%區(qū)間波動，呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.74，P<0.05)。見表1。

用10 ku、3 ku、1 ku超濾膜將提取液分為總提液、大于10 ku、3~10 ku、1~3 ku、小于1 ku五個分子質(zhì)量段。分別命名為DBP-1、DBP-2、DBP-3、DBP-4、DBP-5凍干備用。以對受損傷的H9c2細(xì)胞的抑制活性影響篩選最佳活性組分。

1.2.3 鹿茸血酶解肽對大鼠心肌細(xì)胞增殖抑制活性及炎癥因子分泌的影響

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9c2細(xì)胞

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM（改良型）培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 MTT法測定不同組分對細(xì)胞增殖抑制率的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)密度為每孔4×103個細(xì)胞，將混懸細(xì)胞液接種至96孔培養(yǎng)板上，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模型組、陽性組與樣品組加入100 μL的1 μg/mL LPS造模，空白對照組加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；培養(yǎng)24 h，樣品組加入150 μL濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的各個組分的鹿茸血酶解肽溶液，陽性對照組為150 μL的10 μg/mL卡托普利，每組5個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的5 mg/mL MTT，4 h后棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，于490 nm波長處測其OD值。計算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率/%=[(A模型組-A給藥組)/A模型組]×100%

1.2.3.3 鹿茸血酶解肽對H9c2細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響

將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)密度為每孔4×103個細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模型組、陽性對照組、空白組設(shè)定方法同1.2.3.2，樣品組加入150 μL的 25、50、100、200、400 μg/mL的DBP-5樣品溶液，每組5個復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h后，取上清液 150 μL，按TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒說明書測定各炎癥因子的分泌量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 鹿茸血酶解肽氨基酸組成分析

取分子量小于 1 ku的鹿茸血酶解肽凍干粉（DBP-5）10 mg，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸，配成濃度為1 mg/mL的溶液，110 ℃水解24 h，氨基酸自動檢測儀測定氨基酸組成[11]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個樣品重復(fù)試驗(yàn) 3次，結(jié)果取平均值，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯著性，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)；響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Design Expert 10軟件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹿茸血酶解肽對受損傷的H9c2細(xì)胞增殖抑制的影響

由表1各組細(xì)胞增殖抑制率可以看出，與空白組相比，LPS模型組細(xì)胞顯著增殖（p<0.01），增值率為36.38%，證明LPS模型造模成功；與LPS模型組相比，各給藥組均不同程度地抑制受損傷的H9c2細(xì)胞增殖，其中DBP-5組分活性最強(qiáng)。在25~200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖抑制率隨著樣品濃度的增高而增高，且在25~200 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)濃度超過 200 μg/mL時，細(xì)胞增殖抑制率開始下降。在 200 μg/mL質(zhì)量濃度下，鹿茸血酶解肽對受損傷的H9c2細(xì)胞抑制作用最為顯著（p<0.001）。綜上所述鹿茸血酶解肽各組分對受損傷的H9c2細(xì)胞增值抑制活性結(jié)果為：組分DBP-5在200 μg/mL質(zhì)量濃度下活性最佳，與陽性對照組最為接近，對細(xì)胞的抑制率達(dá)到35.12%。代天[12]等人研究發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮能夠降低受損傷的H9c2細(xì)胞的增殖抑制率，從而來保護(hù)LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷，與本文結(jié)果相似。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率Table 1 Cell proliferation in-hibitory rate in each group (±s, n=3)

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率Table 1 Cell proliferation in-hibitory rate in each group (±s, n=3)

組別 濃度/%25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL 400 μg/mL空白 -模型 36.38±1.18陽性 49.76±0.94 DBP-1 0.16±0.07 4.57±0.31 6.61±0.79 33.39±0.27 20.79±0.94 DBP-2 0.47±0.36 4.41±1.89 5.51±2.05 34.02±1.42 20.31±2.20 DBP-3 0.63±0.24 2.67±0.47 5.35±2.83 34.65±4.72 20.79±1.26 DBP-4 1.89±0.67 4.25±0.79 7.72±4.72 34.96±0.31 21.10±3.15 DBP-5 2.52±2.01 5.83±1.57 9.76±1.57 35.12±2.05 21.42±2.20

2.2 鹿茸血酶解肽對H9c2細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響

2.2.1 鹿茸血酶解肽對H9c2細(xì)胞釋放TNF-α水平的影響

TNF-α是一種細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性。與受體結(jié)合能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如激活蛋白激酶 C、免疫刺激，以及涉及多種炎癥、細(xì)胞生長的基因表達(dá)和激活等。目前研究表明，心肌是發(fā)生心衰時生物合成TNF-a的主要器官。終末期心衰患者血漿TNF-α水平升高，TNF-α對心臟的影響可能表現(xiàn)為抑制心肌收縮力、影響心肌重構(gòu)、促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡等3個方面[13]。由圖1可知，給藥后 H9c2細(xì)胞上清液中TNF-α含量均有不同程度的降低，模型組的TNF-α釋放量為531.05 pg/mL。鹿茸血酶解肽質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，對受損傷的H9c2細(xì)胞釋放TNF-α的量抑制作用最強(qiáng)（p<0.001），TNF-α釋放量為357.93 pg/mL，抑制率提高了32.60%。質(zhì)量濃度超過200 μg/mL時，TNF-α釋放量開始升高。相似研究表明[14]，黃芪多糖對大鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用與減少受損傷的H9c2細(xì)胞TNF-α的分泌量有關(guān)。本研究中的鹿茸血酶解肽同樣能夠通過減少受損傷的H9c2細(xì)胞TNF-α分泌量來達(dá)到對心肌細(xì)胞的保護(hù)。

圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量測定結(jié)果Fig.1 Shows the determination results of TNF-α content in the cell culture medium of each group (±s, n=3)

2.2.2 鹿茸血酶解肽對H9c2細(xì)胞釋放IL-6水平的影響

IL-6是一種小分子可溶性糖蛋白，參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長、增殖、遷移等多種病理生理反應(yīng)。流行病學(xué)證據(jù)顯示血漿IL-6水平與冠心病發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。臨床研究亦顯示血漿IL-6水平和冠心病發(fā)病率、非致死性心梗、冠心病死亡明顯相關(guān)[15]。由圖2可知，不同質(zhì)量濃度的鹿茸血酶解肽對受損傷的H9c2細(xì)胞釋放IL-6的量均有抑制作用。模型組的IL-6釋放量為 185.41 pg/mL。在質(zhì)量濃度達(dá)到 200 μg/mL時，IL-6釋放量達(dá)到最低（p<0.01），為148.69 pg/mL，抑制率提高了 19.80%。質(zhì)量濃度超過 200 μg/mL時，IL-6釋放量開始升高。相似研究證實(shí)[16]，IL-6參與心衰心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)展期心衰患者心肌細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)增加，心力衰竭患者血漿IL-6水平升高。

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6含量測定結(jié)果Fig.2 Shows the determination results of IL-6 content in the cell culture medium of each group (±s, n=3)

2.2.3 鹿茸血酶解肽對 H9c2細(xì)胞釋放 IL-1β水平的影響

IL-1β是細(xì)胞凋亡過程中的重要炎癥因子之一，NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)炎癥因子、趨化因子等，在免疫、炎癥、凋亡中發(fā)揮重要作用[17]，其既可調(diào)節(jié)其下游的促炎癥因子腫瘤壞死因子 IL-1β的表達(dá)，又可被其反饋激活，進(jìn)而放大炎癥反應(yīng)，上調(diào)NF-κB的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]；由圖3可知，隨著則鹿茸血酶解肽質(zhì)量濃度的升高，IL-1β的釋放量逐漸降低。模型組的IL-1β釋放量為70.03 pg/mL，在質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時，IL-1β的釋放量達(dá)到最低（p<0.01），與陽性對照組最為接近，為 62.72 pg/mL，抑制率提高了10.44%。當(dāng)質(zhì)量濃度超過200 μg/mL時，IL-1β的釋放量開始升高。表明鹿茸血酶解肽可能通過抑制 IL-1β的釋放量來發(fā)揮其對 LPS誘導(dǎo)的 H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用，且在質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時活性最佳。相似研究表明[17]，黃芪多糖通過減少受 LPS誘導(dǎo)損傷的 H9c2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的量，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

圖3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量測定結(jié)果Fig.3 Shows the determination results of IL-1β content in the cell culture medium of each group (±s, n=3)

2.3 鹿茸血酶解肽的氨基酸組成

鹿血酶解肽氨基酸組成分析結(jié)果及含量如表2所示。由表2可知，鹿血酶解肽中含有17種氨基酸，其中Lys含量在鹿血酶解肽氨基酸總含量中占比最高，占17.81%；劉君雯[19]等人研究發(fā)現(xiàn)Lys可使p53蛋表達(dá)顯著降低,使bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高,并使bcl-2/bax比值增高,從而抑制細(xì)胞損傷凋亡。初步認(rèn)為Lys可能是其保護(hù)機(jī)體、減少凋亡的機(jī)制之一。人體必需氨基酸（Lys、Phe、Val、Leu、Thr、Ile、Met）含量較高，占氨基酸總含量的 52.78%。Thr、Ile、Met低于人體必需氨基酸模式，其它幾種必需氨基酸均高于或與人體模式相近。這表明鹿血具有較高的營養(yǎng)價值以及保健功能。黃開華等人用胰蛋白酶酶解鹿血制備抗氧化活性肽時Leu、Lys和Ala的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為17.2%、12.3%和12.1%，與堿性蛋白酶酶解結(jié)果有所差異，這可能與酶對氨基酸形成肽鍵的催化水解有較強(qiáng)的專一性有關(guān)[20]。

表2 鹿茸血酶解肽氨基酸組成及含量Table 2 Deer antler blood enzymatic peptide amino acid composition and content

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同組分及不同濃度的鹿茸血酶解肽均可抑制損傷的H9c2細(xì)胞的增殖，其中組分DBP-5、濃度為200 μg/mL的鹿茸血酶解肽對受損傷的H9c2細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)（p<0.001），抑制率為35.12%。組分DBP-5質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時，給藥后 H9c2細(xì)胞上清液中炎癥因子 TNF-α（p<0.001）、IL-6（p<0.01）、IL-1β（p<0.01）釋放量與模型組相比達(dá)到最低，鹿茸血酶解肽中具有抑制細(xì)胞損傷凋亡的Lys含量最高，證明了鹿茸血酶解肽對LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，且茸鹿血酶解肽對LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用與其抑制炎癥因子的釋放密切相關(guān)。但是中藥在治療疾病時具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[21]，所以鹿血肽在治療心血管疾病方面的作用值得深入研究。