王一飛 薛鋒

(上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院骨科，上海 201400)

骨折愈合的過程是骨再生的過程，需要適合的生物力學(xué)環(huán)境，還要通過多種組織和細(xì)胞因子之間相互作用，促進(jìn)骨折愈合〔1〕。研究數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)近幾年高能量損傷和開放性損傷的患者人數(shù)增多，骨折不愈合的患者人數(shù)也有所增加〔2〕。骨折不愈合仍是治療的難題，引起專家和學(xué)者的高度重視。研究數(shù)據(jù)顯示，黃精多糖有降血脂、抗病毒、提高免疫功能、延緩衰老的功效〔3,4〕。本研究旨在探討黃精多糖對(duì)脛骨骨折模型大鼠骨折愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇23只SD健康雄性大鼠，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠年齡為6～9周齡，平均(7.5±0.5)周齡，體重為210～220 g,平均(214.4±3.5)g，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，室內(nèi)濕度35%～40%，飼養(yǎng)室定時(shí)進(jìn)行紫外線照射消毒。統(tǒng)一喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料，允許自由活動(dòng)，飼養(yǎng)時(shí)間為1 w。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1脛骨骨折模型建立及分組 參考劉建軍等〔5〕建模標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行適當(dāng)修改，選取18只大鼠使用5%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，選取大鼠右后肢進(jìn)行脫毛處理，消毒，在小腿1/3處行前正中切口，長(zhǎng)度約1.5 cm，將大鼠皮膚、皮下組織和筋膜切開后，脛前肌扒開，在脛骨結(jié)節(jié)下1.0 cm處，將脛骨橫行切斷。采用1.0 mm的克氏針經(jīng)過遠(yuǎn)端的髓腔穿出后，復(fù)位，采取逆行方式打入骨折的近端。之后使用生理鹽水清洗干凈，將切口逐層關(guān)閉。手術(shù)后對(duì)大鼠進(jìn)行肌注青霉素8萬U/100 g，1次/d，連續(xù)肌注3 d。建模過程中，死亡3只，建模成功15只。將15只大鼠隨機(jī)分為模型組、低、高劑量黃精多糖組，各5只，正常組大鼠5只。黃精多糖溶入10 ml的生理鹽水中，進(jìn)行灌胃治療，低劑量黃精多糖組大鼠服用劑量為100 mg/kg，高劑量黃精多糖組大鼠服用劑量為350 mg/kg，1次/d，正常組和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水治療，連續(xù)治療30 d。

1.2.2大鼠骨痂體積和脛骨濕重 大鼠處死前采集血清，抽取股動(dòng)脈血，保存在肝素鈉抗凝管中，每管2 ml，-20℃環(huán)境下保存，待測(cè)。大鼠處死后采用自制的照相模板將大鼠的下肢進(jìn)行固定，正側(cè)位拍攝X射線片，曝光參數(shù)設(shè)置：電壓60 kV，電流7 mA，0.035 s，52 cm。觀察大鼠的骨痂形成情況。取大鼠全長(zhǎng)的脛骨，在進(jìn)行標(biāo)本采集的過程中，保護(hù)骨折周圍組織，防止對(duì)骨痂造成破壞。將固定物去除后，使用天平稱取全長(zhǎng)脛骨濕重。

1.2.3觀察大鼠脛骨近端骨形態(tài) 大鼠處死后采用Micro-CT骨形態(tài)計(jì)量學(xué)進(jìn)行分析，將大鼠脛骨的肌肉、軟組織剔除后，使用生理鹽水將血液沖洗干凈，做好標(biāo)記后凍存。使用100 g/L的多聚甲醛將大鼠脛骨固定，使用Micro-Ct掃描，分辨率為18 μm。數(shù)據(jù)參數(shù)設(shè)置電壓50 kV，電流500 μA，銅質(zhì)濾片為0.5 mm進(jìn)行掃描，主要檢測(cè)指標(biāo)包括：骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度。

1.2.4脛骨骨折骨組織形態(tài)學(xué)觀察 所有大鼠處死后取出骨組織，在10%的甲醛固定保持48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理后，采用蘇木素-伊紅(HE)進(jìn)行染色，在顯微鏡下(×100)觀察大鼠脛骨骨折骨組織形態(tài)學(xué)特征。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定篾這內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、骨鈣素及血清生化指標(biāo)水平 采用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/ml，在96孔酶標(biāo)板中加入100 μl/孔，4℃過夜保存。第2天舍棄包被液，采用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，沒孔中加入1%的150 μl 牛血清白蛋白(BSA)，在37℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl,稀釋后的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，之后，使用顯色劑顯色20 min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值，從而測(cè)定VEGF、骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶水平。

1.2.6Western印跡檢測(cè)Col1a1、抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP)5、組織蛋白酶(CTS)K蛋白表達(dá) 將采集到的標(biāo)本，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，裂解處理35 min，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃的環(huán)境下孵育24 h；之后TBST緩沖液清洗處理，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，使用TBST緩沖液反復(fù)清洗。加入顯影劑將其浸在底物溶液中進(jìn)行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組術(shù)后脛骨濕重和骨痂體積比較 低、高劑量黃精多糖組術(shù)后脛骨濕重和骨痂體積均顯著高于模型組，且高劑量黃精多糖組顯著高于低劑量黃精多糖組(均P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠術(shù)后脛骨濕重和骨痂體積X線比較

表1 各組大鼠脛骨濕重和骨痂體積比較

2.2各組大鼠脛骨近端骨形態(tài)比較 各組骨小梁厚度比較無顯著差異(P>0.05)。正常組、低、高劑量黃精多糖組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量均顯著高于模型組(均P<0.05)；低、高劑量黃精多糖組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量均顯著低于正常組(均P<0.05)；高劑量黃精多糖組骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量顯著高于低劑量黃精多糖組(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 4組大鼠脛骨近端骨Micro-Ct比較

表2 各組脛骨濕重、骨痂體積及近端骨形態(tài)及VEGF、骨鈣素及血清生化指標(biāo)水平比較

2.3各組大鼠脛骨骨折骨組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組骨組織清晰，可觀察到骨板；模型組骨組織破壞嚴(yán)重，骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少；低劑量黃精多糖組骨組織中有少量的成骨細(xì)胞聚集；高劑量黃精多糖組骨組織中有大量的成骨細(xì)胞。見圖3。

圖3 4組大鼠脛骨骨折骨組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×100)

2.4各組VEGF、骨鈣素及血清生化指標(biāo)水平比較 正常組、低、高劑量黃精多糖組VEGF、骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶水平均顯著高于模型組(均P<0.05)；低、高劑量黃精多糖組VEGF、骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶水平均顯著低于正常組大鼠(均P<0.05)；高劑量黃精多糖組VEGF、骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶水平均顯著高于低劑量黃精多糖組大鼠(均P<0.05)。見表2。

2.5各組Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)比較 正常組、低、高劑量黃精多糖組Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型組(均P<0.05)；低、高劑量黃精多糖組Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05)；高劑量黃精多糖組Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量黃精多糖組(P<0.05)。見表3。

表3 4組Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)比較

3 討 論

骨折愈合的過程包含多個(gè)階段，同時(shí)受機(jī)體中多因素調(diào)控，翁文玉等〔6〕研究指出，骨折愈合過程中有多種細(xì)胞因子參與，通過細(xì)胞外基質(zhì)的重建作用，一些血清因子在骨形成的過程中發(fā)揮著重要作用。在正常的骨組織中有大量的神經(jīng)分布，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在骨膜和骨質(zhì)中也存在大量的神經(jīng)纖維〔7，8〕。在骨新陳代謝中，大量的神經(jīng)肽物質(zhì)參與，主要通過骨膜和骨髓血流和血管的改變，對(duì)骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性產(chǎn)生顯著的影響〔9〕。

本研究結(jié)果說明黃精多糖對(duì)大鼠脛骨骨折愈合有一定的積極作用。研究顯示成骨細(xì)胞影響骨形成，破骨細(xì)胞影響骨吸收，是骨重建過程中重要的細(xì)胞因子，當(dāng)破骨細(xì)胞活性提高，成骨細(xì)胞的活性降低時(shí)，破骨細(xì)胞影響舊骨的吸收速度，其影響強(qiáng)度大于成骨細(xì)胞對(duì)新骨的影響〔10，11〕。張磊等〔12〕研究結(jié)果顯示，黃精多糖在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠中骨密度水平升高，控制了骨丟失，改善了骨微環(huán)境。

VEGF在血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有激活作用，促進(jìn)聚集，有助于細(xì)胞之間的整合和成熟〔13〕。武永娟等〔14〕研究顯示成骨細(xì)胞因子和血管細(xì)胞因子之間相互作用，在骨愈合中得到釋放，可提高骨愈合的速度。孫成群等〔15〕研究指出，經(jīng)過治療后，骨痂中的血管因子顯著表達(dá)，軟骨細(xì)胞的數(shù)量增加，骨痂形成，促進(jìn)鈣化，縮短了骨髓腔再通時(shí)間。本研究結(jié)果說明黃精多糖能改善骨鈣素、鈣、磷、堿性磷酸酶水平。何基琛等〔16〕研究指出，黃精多糖能抑制巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，但其干擾機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。ACP5屬于一種單體金屬蛋白酶，主要在哺乳動(dòng)物糖基化中表達(dá)，在活化的破骨細(xì)胞中顯示高水平，是破骨細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分化的重要標(biāo)志性因子〔17〕。CTSK是肽酶C1家族的重要成員，集中在破骨細(xì)胞中表達(dá)，在骨吸收過程中發(fā)揮著重要作用〔18〕。破骨細(xì)胞主要是由大量的單核巨噬細(xì)胞融合形成，主要的作用是分解酸、溶酶體及分解骨基質(zhì)，在機(jī)體中促進(jìn)血鈣的調(diào)節(jié)〔19，20〕。本研究說明黃精多糖對(duì)骨形成相關(guān)蛋白有顯著的抑制作用，通過促進(jìn)VEGF、骨鈣素水平表達(dá)抑制Col1a1、ACP5、CTSK相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中高劑量的黃精多糖作用效果更加明顯。說明黃精多糖在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

綜上，黃精多糖對(duì)脛骨骨折模型大鼠作用顯著，能改善骨微環(huán)境，黃精多糖通過促進(jìn)VEGF、骨鈣素表達(dá)抑制Col1a1、ACP5、CTSK蛋白表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合。