王鐵峰 王剛 牛占峰

(1海南省第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 五指山 572299；2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)外科)

人膠質(zhì)母細胞瘤是常見的人腦內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率〔1〕。當前已有多種能夠治療膠質(zhì)瘤的方法，如藥物治療、手術(shù)治療等，但仍具有一定的缺陷性，治療效果不佳〔2，3〕。MicroRNA是一種廣泛分布的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs(約為22個核苷酸)，其特點是可以結(jié)合到mRNA的3′UTR端來發(fā)揮其負調(diào)控基因表達的作用〔4〕?，F(xiàn)已證實，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密聯(lián)系〔5〕。已有研究表明，miRNA在膠質(zhì)瘤細胞中具有差異性表達，并在細胞的增殖、遷移、凋亡中扮演重要角色。miR-128通過靶向ARP5/Bmi-1/E2F-3a從而調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤的增殖〔6〕。miR-328通過靶向ABCG2降低膠質(zhì)母細胞瘤的耐藥性〔7〕。miR-125a-5p通過靶向TAZ可抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖并促進其進行分化〔8〕。miR-181c-5p也是miRNA家族中的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p在多種疾病的發(fā)生中具有重要作用，LncRNA可通過miR-181c-5p競爭性結(jié)合從而調(diào)控巨噬細胞自噬〔9〕。miR-181c-5p通過調(diào)控白血病抑制因子從而調(diào)控高糖介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能障礙〔10〕。miR-181c-5p通過靶向SMAD7調(diào)節(jié)神經(jīng)母細胞瘤的生物學活性〔11〕。但miR-181c-5p在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達及其調(diào)控機制目前還不清楚。本研究擬分析miR-181c-5p在膠質(zhì)瘤細胞中的表達及對其生物學活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87購于美國ATCC公司；細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購于Sigma；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購于promega公司；NDRG2-3′UTR和NDRG2-3′UTR MUT由擎科生物有限公司設(shè)計；miR-181c-5p mimics及NC-mimics、 miR-181c-5p inhibitor及NC-inhibitor由上海吉瑪制藥公司設(shè)計并合成。CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板購于康寧；NDRG2、GAPDH等抗體購于碧云天生物。

1.2臨床樣本 從在醫(yī)院進行手術(shù)治療的膠質(zhì)母細胞瘤患者中，收集30例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本及鄰近的正常組織樣本。組織離體后在液氮中進行快速冷凍，在使用臨床樣本實驗前應對其進行蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定。本研究已獲得倫理委員會批準，并在取樣時得到了患者許可。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87細胞在含有2.5%FBS、5%馬血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。每3天進行一次換液。當細胞處于對數(shù)生長期時即可用于進行其他生物學實驗。

將處于對數(shù)生長期的U87細胞接種至6孔板中，每孔約2×105個細胞。然后使用轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)實驗設(shè)計，miR-181c-5p mimics組、miR-181c-5p inhibitor組、NC-mimics組、NC-inhibitor組及對照組分別將miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor及相對應的陰性對照(NC-mimics、NC-inhibitor)及等量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)入U87細胞中，轉(zhuǎn)染結(jié)束后在培養(yǎng)條件下進行72 h培養(yǎng)。

1.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 根據(jù)TRIzol Reagent 使用說明書操作提取人膠質(zhì)母細胞瘤組織及U87細胞中的總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-181c-5p：上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAACA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；NDRG2：上游引物5′-CTGGAACAGCTACAACAACC-3′，下游引物5′-CCCCTCAGCTATAGACACCT-3′；GAPGH：上游引物5′-GGTGAAGGCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。按照說明書配制qRT-PCR體系，反應條件為95℃預變性30 s，40個循環(huán)擴增反應(95℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPGH為NDRG2內(nèi)參，U6為miR-181c-5p的內(nèi)參，2-△△Ct法計算miR-181c-5p、NDRG2的相對表達。

1.5Western印跡檢測蛋白表達情況 使用組織/細胞裂解液對組織/細胞進行裂解，然后收集總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。分別取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜上，然后使用5%脫脂奶粉對其進行1 h封閉，使用1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)將膜清洗3次。加入相應的一抗置于4℃搖床過夜孵育，清洗后，加入二抗進行室溫孵育1 h，清洗后加入ECL顯影液顯影。

1.6CCK-8檢測細胞增殖 鋪處于生長期的U87細胞至96孔板中，進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，然后向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑并混勻，并設(shè)置空白對照。37℃下避光孵育1 h，使用酶標儀測定波長450 nm的吸光度值。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 取處于生長期的U87細胞至24孔板中，進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。使用胰酶消化U87細胞并用無血清培養(yǎng)基進行重懸，使用臺盼藍染色技術(shù)調(diào)整細胞密度為2×108/L，然后取細胞懸液100 μl加至Transwell小室上層向，Transwell小室下層中加入500 μl 10%血清完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h后取出小室，1倍PBS清洗后用棉簽輕輕擦除上室中未發(fā)生遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定20 min，1倍PBS清洗3次后使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，1倍PBS清洗后，隨機選擇5個視野，計數(shù)下室染色細胞。

將提前凍存的基質(zhì)膠置于4℃直至溶成液態(tài)，使用400 μl無血清培養(yǎng)基對50 μl基質(zhì)膠原液進行稀釋并輕輕搖晃混勻。取50 μl稀釋液加至Transwell小室的上室中，置于37℃培養(yǎng)箱中進行孵育，當凝固后加入100 μl無血清培養(yǎng)基浸潤凝膠，吸棄，后續(xù)步驟與遷移實驗相同。通過計數(shù)穿膜細胞數(shù)來反映細胞侵襲能力。

1.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取處于生長期的U87細胞至24孔板中，進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。使用不含EDTA的胰酶消化U87細胞并用無血清培養(yǎng)基進行重懸。1 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入500 μl 1倍結(jié)合緩沖液對細胞進行重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI并輕輕搖晃混勻，室溫避光5 min后使用流式細胞術(shù)統(tǒng)計各組凋亡率。

1.9生物信息學預測miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學網(wǎng)站miRBD和targetscan聯(lián)合預測miR-181c-5p的靶基因。

1.10雙熒光素酶報告實驗 取GIST-T1細胞制備成單細胞懸液，接種于96孔板，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按說明書操作進行共轉(zhuǎn)染，然后將細胞分為4組：野生型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR)、野生型實驗組(轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR)、突變型質(zhì)粒對照組(轉(zhuǎn)染mimics-NC和NDRG2-3′ UTR MUT)、突變型質(zhì)粒實驗組(轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics和NDRG2-3′ UTR MUT)。對其培養(yǎng)24 h后裂解細胞，并按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.11統(tǒng)計學方法 采用GRAPDprism6.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-181c-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達 與正常組織(0.88±0.13)相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的miR-181c-5p(1.80±0.20)顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.2miR-181c-5p可以調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤的生物學功能 與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞中miR-181c-5p顯著增加(P<0.001)，而NC mimics組與對照組無明顯差異(P<0.05)。與對照組相比，miR-181c-5p inhibitor組中miR-181c-5p表達顯著降低(P<0.001)。見表1。

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞吸光度顯著增加(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞吸光度顯著下降(P<0.05)，而NC-inhibitor與對照組無明顯差異(P>0.05)。

Transwell細胞遷移實驗顯示，與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞遷移率、侵襲率顯著上升(P<0.01,P<0.05)，而NC組與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)；與對照組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞遷移率、侵襲率顯著下降，而NC-inhibitor與對照組沒有顯著差異性(P>0.05)。見表1、圖1、圖2。與對照組相比，miR-181c-5p mimics組的U87細胞凋亡率下降(P<0.01)，而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與NC-inhibitor組相比，miR-181c-5p-inhibitor組U87細胞凋亡率增加(P<0.01)，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見表1、圖3。

圖1 細胞遷移實驗(結(jié)晶紫染色，×40)

圖2 細胞侵襲實驗(結(jié)晶紫染色，×40)

圖3 流式細胞術(shù)檢測U87細胞凋亡

表1 miR-181c-5p可調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞U87的生物學活性

2.3miR-181c-5p的靶基因 通過生物信息學在線分析軟件miRbase和Targetscan預測miR-181c-5p的靶基因，結(jié)果顯示NDRG2可能是miR-181c-5p的靶基因，存在互補的結(jié)合位點(圖4)。通過雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-181c-5p mimics組NDRG2 3′UTR的相對熒光素酶活性明顯受到抑制，而NDRG2 3′UTR MUT的相對熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗分析miR-181c-5p與NDRG2間的靶向結(jié)合作用

圖4 miR-181c-5p與NDRG2間的結(jié)合序列

2.4miR-181c-5p對NDRG2基因的表達調(diào)控 與對照組相比，U87細胞中轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics后可顯著下調(diào)NDRG2 mRNA表達和蛋白表達。而NC-mimics組與對照組沒有差異性(P>0.05)；與對照組組相比，U87細胞中轉(zhuǎn)染miR-181c-5p-inhibitor可上調(diào)NDRG2 mRNA表達和蛋白表達，而NC-inhibitor與對照組沒有差異性(P>0.05)。見圖5、表3。

圖5 Western印跡檢測NDRG2蛋白表達

表3 qRT-PCR檢測miR-181c-5p mimics、NC-mimics轉(zhuǎn)染后NDRG2 mRNA表達

3 討 論

人膠質(zhì)母細胞瘤是常見的腦部惡性腫瘤之一，其復發(fā)性高，死亡率高。已通過分子生物學、遺傳學、病理學等方法的結(jié)合對其進行了探究，為臨床治療該疾病提供了許多價值資料。

miRNA是一種約22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系〔12〕。能夠通過與靶基因的mRNA 3′UTR區(qū)域直接結(jié)合進而調(diào)控腫瘤發(fā)生中的生物學活性，如細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲、細胞凋亡等〔13，14〕。研究表明，多種miRNA在GSM發(fā)生發(fā)展中更具有重要作用，如miR-181d〔15〕、miRNA-154-5p〔16〕、miR-21〔17〕、miR-429〔18〕等。本研究與前期研究結(jié)果一致〔19〕，表明miR-181c-5p在膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。在U87細胞中進一步通過實驗證實，miR-181c-5p的表達可促進細胞增殖、遷移及侵襲且抑制細胞凋亡。通過生物信息學在線分析網(wǎng)站預測出NDRG2是miR-181c-5p的靶基因，能夠與NDRG2 3′UTR區(qū)域結(jié)合而影響生物學活性。并通過雙熒光素酶實驗證實miR-181c-5p可以直接結(jié)合NDRG2 3′UTR區(qū)域且這種結(jié)合是靶向抑制的。研究表明NDRG2作為NDRG家族的重要成員，在參與組織胚胎發(fā)育、細胞分化及血液免疫中具有重要作用，同時也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔11，20～24〕。Deng等〔25〕研究表明在膠質(zhì)瘤中NDRG2表達下調(diào)，與本研究結(jié)果一致。

綜上，miR-181c-5p通過靶向抑制NDRG2的表達，進而調(diào)節(jié)人膠質(zhì)細胞瘤的生物學活性。miR-181c-5p成為治療膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點。