金浩 余佳 王梓瑜 喬鷗 王軍 韓江 李兆連

(1云南省第一人民醫(yī)院(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院)普通外科，云南 昆明 650032；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科)

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病死率高〔1〕。治療仍然采用外科手術(shù)為主的綜合治療方式，化學(xué)治療、放射治療等多元化治療也取得了較大進(jìn)展〔2〕。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，靶向治療已成為肝癌治療的新途徑，靶向藥物的出現(xiàn)給肝癌患者帶來了新希望〔3〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是基因調(diào)控的重要組成部分，在表觀遺傳水平和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后治療等過程〔4〕。DLEU2在宮頸癌中低表達(dá)，過表達(dá)DLEU2能抑制宮頸癌細(xì)胞Hela和Caski的增殖、遷移和侵襲〔5〕。DLEU2通過miR-16-1影響喉癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲〔6〕。而DLEU2對肝癌的影響未見報道。LncRNA作為內(nèi)源競爭RNA(ceRNA)調(diào)控miRNA豐富了肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制〔7〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)特定miRNA的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)〔8〕。miR-374在肝癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)〔9〕；miR-374a高表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔10〕。本文旨在研究DLEU2對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其與miR-374a-5p的調(diào)控機(jī)制，為肝癌的早期診斷和治療提供新靶點和新方法。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402和正常肝細(xì)胞HL-7702購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Sigma公司；Trizol試劑、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光(ECL)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402和正常肝細(xì)胞HL-7702使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液1次，待細(xì)胞融和至60%～70%時，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取常規(guī)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-374a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-374a-5p mimics)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-DLEU2組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-DLEU2組(轉(zhuǎn)染si-DLEU2)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-374a-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-374a-5p)、miR-NC+WT-DLEU2組(共轉(zhuǎn)染miR-NC和WT-DLEU2)、miR-NC+MUT-DLEU2組(共轉(zhuǎn)染miR-NC和MUT-DLEU2)、miR-374a-5p+WT-DLEU2組(共轉(zhuǎn)染miR-374a-5p和WT-DLEU2、miR-374a-5p+MUT-DLEU2組(共轉(zhuǎn)染miR-374a-5p和MUT-DLEU2)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2和miR-NC)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2和miR-374a-5p)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h時加入20 μl(5 g/L)MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖活力=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.5Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 各組細(xì)胞胰酶消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×104個/ml。細(xì)胞遷移實驗：取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取6個視野拍照，計算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：以1∶5比例加入RPMI1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3次。

1.7qRT-PCR檢測miR-374a-5p和DLEU2 mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.8Western印跡檢測 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.9熒光素酶報告基因檢測實驗檢測DLEU2對miR-374a-5p的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示DLEU2 3′UTR區(qū)域有miR-374a-5p結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點DLEU2的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-DLEU2和MUT-DLEU2)，取對數(shù)生長期肝癌HepG2細(xì)胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細(xì)胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-DLEU2和MUT-DLEU2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-374a-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DLEU2在肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402和正常肝細(xì)胞HL-7702中的表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與HL-7702組(1.33±0.13)相比，HepG2、BEL-7402組細(xì)胞中DLEU2 mRNA的表達(dá)水平(0.38±0.11、0.76±0.15)顯著降低，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=79.911，P=0.000)。

2.2DLEU2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2后，分別于24、48、72 h時檢測細(xì)胞增殖，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，相較于pcDNA3.1組，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

圖1 DLEU2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402凋亡的影響

圖2 DLEU2過表達(dá)對凋亡蛋白表達(dá)的影響

表1 過表達(dá)DLEU2對細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響

2.3DLEU2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2的遷移、侵襲的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞中N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 DLEU2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2的遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

表2 DLEU2對細(xì)胞HepG2遷移、侵襲的影響

2.4DLEU2靶向調(diào)控miR-374a-5p 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到DLEU2與miR-374a-5p存在結(jié)合位點(圖5)。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型DLEU2基因表達(dá)載體WT-DLEU2后，相較于miR-NC組，miR-374a-5p組WT-DLEU2肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型DLEU2基因表達(dá)載體MUT-DLEU2后，相較于miR-NC組，miR-374a-5p組MUT-DLEU2肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性差異不無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相較于pcDNA組(0.88±0.08)，pcDNA-DLEU2組肝癌細(xì)胞中miR-374a-5p的表達(dá)水平(0.13±0.01)顯著降低(P<0.05)；相較于si-NC組(0.83±0.08)，si-DLEU2組(1.47±0.15)顯著升高(P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖5 DLEU2中含有miR-374a-5p的互補(bǔ)核苷酸序列

2.5抑制miR-374a-5p對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組細(xì)胞中miR-374a-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡檢測結(jié)果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細(xì)胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖6，表4。

表4 抑制miR-374a-5p對凋亡、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

圖6 抑制miR-374a-5p對細(xì)胞HepG2凋亡、遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)

MTT法檢測結(jié)果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-374a-5p對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.6過表達(dá)miR-374a-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組細(xì)胞中miR-374a-5p的表達(dá)水平顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細(xì)胞中Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖7，表6。

表6 miR-374a-5p過表達(dá)對細(xì)胞HepG2中凋亡、侵襲蛋白表達(dá)的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞活性顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細(xì)胞的凋亡率顯著升高；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組顯著降低(P<0.05)。見表7。

1～4：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-DLEU2組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組圖7 過表達(dá)miR-374a-5p對凋亡、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表7 過表達(dá)miR-374a-5p能夠逆轉(zhuǎn)DLEU2對細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的作用

3 討 論

傳統(tǒng)的手術(shù)治療對早期肝癌有一定療效，但仍存在癌癥的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等問題，而靶向治療可以降低或消除這些情況〔11〕。尋找影響肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的腫瘤分子靶標(biāo)和作用機(jī)制，對于肝癌早期診斷及術(shù)后患者長期生存有重要作用〔12〕。LncRNA的分子調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，隨著在肝癌中的研究，其在肝癌中占據(jù)越來越重要的作用〔13〕。DLEU2位于慢性淋巴細(xì)胞白血病的13q14刪除基因座上〔14〕；DLEU2通過miR-15a/miR-16-1負(fù)調(diào)節(jié)G1細(xì)胞周期蛋白E1和D1進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞系集落形成〔15〕；DLEU2可提高miR-15a/miR-16-1的表達(dá)治療慢性淋巴細(xì)胞白血病〔16〕。組蛋白去乙?；敢种苿┰诜切〖?xì)胞肺癌中通過HDAC3增加Dleu2/miR-15a/16-1的表達(dá)〔17〕。DLEU2還影響宮頸癌〔5〕、喉癌〔6〕的發(fā)展過程。但還未見DLEU2在肝癌中的相關(guān)研究，本研究結(jié)果表明，DLEU2在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)DLEU2可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；還能抑制Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bax、E-cadherin蛋白的表達(dá)。DLEU2可靶向調(diào)控miR-374a-5p的表達(dá)。

miR-374參與了多種疾病的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)，miR-374a-5p是肥胖炎癥過程的一種潛在調(diào)節(jié)劑〔18〕。上調(diào)miR-374b-5p可通過抑制RECK表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲〔19〕。miR-374b-5p在胰腺癌組織中顯著低表達(dá)，上調(diào)miR-374b-5p通過下調(diào)多種抗凋亡蛋白減弱了胰腺癌的化療耐藥性〔20〕。miR-374a-5p在骨肉瘤患者中的表達(dá)顯著升高，作為骨肉瘤的潛在無創(chuàng)生物標(biāo)志物〔21〕。miR-374a在膀胱尿路上皮癌患者中上調(diào)表達(dá)〔22〕；miR-374a-5p在乳腺癌〔23〕、肺癌〔24〕中上調(diào)表達(dá)。miR-374-5p下調(diào)可抑制雄性大鼠生長板軟骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)肥大分化〔25〕。miR-374a-5p低表達(dá)有利于結(jié)腸癌患者的存活〔26〕。蛋白激酶C抑制劑GF109203X可誘導(dǎo)體外人表皮細(xì)胞去分化，上調(diào)miR-374a-5p的表達(dá)〔27〕。本研究結(jié)果表明，抑制表達(dá)miR-374a-5p可抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過表達(dá)miR-374a-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進(jìn)作用。

綜上，LncRNA DLEU2可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與靶向miR-374a-5p基因有關(guān)，將可為肝癌的早期診斷預(yù)防、治療和預(yù)后提供新靶點。