段曉英 杜珍武 丁宏 楊忠影 曹振強(qiáng)

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130022)

金雀異黃素(Gen)又稱金雀異黃酮、染料木黃素、染料木黃酮、4′，5，7-三羥基異黃酮，是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮類化合物。Gen是強(qiáng)力酪氨酸蛋白激酶的抑制劑和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑。它具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，能通過多種途徑抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔1～4〕。同時(shí)，Gen也是一種理想的抗氧化劑，它可以清除活性氧自由基，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，誘導(dǎo)提高抗氧化酶活性水平。研究表明，Gen的抗氧化機(jī)制可以抑制大腦神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而起到保護(hù)中樞神經(jīng)的作用〔5～8〕。雪旺細(xì)胞(SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特有的膠質(zhì)細(xì)胞，是髓鞘形成的功能細(xì)胞，在維持神經(jīng)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)損傷修復(fù)過程中起著重要作用。如何保護(hù)SCs是周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵。對Gen的周圍神經(jīng)保護(hù)作用〔9〕報(bào)道較少，因此本研究擬在體外細(xì)胞模型探討Gen對SCs生長的影響及其相關(guān)機(jī)制，為Gen在周圍神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)中應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1大鼠SCs培養(yǎng) RSC96大鼠SCs購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。將RSC96細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞活性測定 Gen溶于二甲基亞砜(DMSO)。將RSC96的細(xì)胞以2 000/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的Gen，其濃度分別為4.625 μmol/L，9.250 μmol/L，18.500 μmol/L，37.000 μmol/L，74.000 μmol/L，148.000 μmol/L。同時(shí)設(shè)對照組(不加藥)及DMSO組。培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8(北京天恩澤) 10 μl，作用1 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行OD值檢測。之后，每隔24 h檢測1次，共檢測5次。同時(shí)應(yīng)用倒置顯微鏡(德國徠卡)進(jìn)行細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)觀察。

1.3細(xì)胞周期檢測 以1×105/瓶細(xì)胞數(shù)將RSC96細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分為Gen 74.000 μmol/L組、對照組、DMSO組，每組3瓶。培養(yǎng)24 h后，胰酶消化細(xì)胞，吸取細(xì)胞消化液，1 200 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞。加入1 ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定。12 h后1 200 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，加入1 ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，重懸細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，吸除上清。加入碘化丙啶染色液(碧云天試劑)，37℃避光溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.4細(xì)胞凋亡的熒光染色檢測 RSC96細(xì)胞以1×104/孔細(xì)胞數(shù)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入濃度為37.000 μmol/L及74.000 μmol/L的Gen，同時(shí)設(shè)對照組(不加藥)。藥物作用24 h后，應(yīng)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)，C1062S)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。具體方法：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌1次，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育20 min，隨后置于冰浴中。在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光。隨機(jī)拍照5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)染色細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算染色細(xì)胞的百分比。

1.5基因表達(dá)檢測 RSC96細(xì)胞以1×106/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入74.000 μmol/L Gen與4 μl DMSO，藥物作用24 h后，收集細(xì)胞，加入Trizol(Invitrogen)裂解細(xì)胞，通過氯仿抽提、異丙醇沉淀及70%乙醇純化獲取細(xì)胞總RNA，獲得RNA通過凝膠電泳觀察完整性，通過紫外測定260 nm與280 nm OD值評價(jià)提取RNA質(zhì)量與純度。 取1 μg提取的總RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒(大連寶生物)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR檢測大鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(BCL)2、胱天蛋白酶(CASP)3、腫瘤蛋白P53(TP53)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(CDKN)1B、CDKN1A的表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。各基因表達(dá)檢測引物：BCL2：上游：CCGGGAGAACAGGGTATGATAA，下游：CCCACTCGTAGCCCCTCTG；CASP3：上游：GGAGCTTGGAACGCGAAGAA，下游：ACACAAGCCCATTTCAGGGT；TP53：上游：TACTTCCCAGCAGGGTGTCA，下游：ACACTTGGAGGGCTTCCTCT；CDKN1A：上游：GGGATGCATCTATCTTGTGATATGT，下游：CGAACAGACGACGGCATACT；CDKN1B：上游：TCGACGCCAGACGTAAACAG，下游：CGCAATGCTACATCCAATGCT，內(nèi)參基因GAPDH：上游：TAGACAAGATGGTGAAGGTCGG，下游：CTTGACTGTGCCGTTGAACTTG。

2 結(jié) 果

2.1Gen對RSC96細(xì)胞周期的影響 Gen 37.000 μmol/L組RSC96細(xì)胞處在G2/M期細(xì)胞比例明顯多于對照組(P<0.05)，而G1期細(xì)胞比例明顯減少，明顯少于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞周期比較

2.2Gen對大鼠RSC96細(xì)胞生長的影響 Gen 37.000 μmol/L組RSC96細(xì)胞活性在72 h及96 h明顯低于對照組(P<0.05)。Gen 74.000 μmol/L組及148.000 μmol/L組，從24 h開始直到120 h細(xì)胞活性均明顯低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表2。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示Gen 37.000 μmol/L組、74.000 μmol/L及148.000 μmol/L組72 h細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少。見圖1。

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞活性比較

圖1 Gen作用大鼠RSC96細(xì)胞72 h倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)(×100)

2.3Gen誘導(dǎo)大鼠RSC96細(xì)胞凋亡 與對照組〔(1.561±0.381)%〕相比，Gen 37.000 μmol/L組凋亡細(xì)胞數(shù)〔(2.827±0.641)%〕有所增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Gen 74.000 μmol/L組凋亡細(xì)胞數(shù)〔(34.458±4.351)%〕顯著增多,明顯高于對照組和Gen 37.000 μmol/L組(均P<0.01)。見圖2。

圖2 Gen作用大鼠RSC96細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡(×100)

2.4Gen對RSC96細(xì)胞生長相關(guān)基因表達(dá)影響 與DMSO組相比，Gen 74.000 μmol/L組作用24 h后，CDKN1A基因表達(dá)明顯升高，其余基因表達(dá)無變化。見表3。

表3 各組CASP3、BCL2、CDKN1B、CDKN1A及TP53 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

在我國，中老年糖尿病的發(fā)病率逐年升高。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是最常見、最復(fù)雜的并發(fā)癥之一，其中70%～80%的中老年糖尿病患者都會出現(xiàn)感覺和運(yùn)動神經(jīng)損傷，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，甚至影響生存。SCs是周圍神經(jīng)修復(fù)過程中最關(guān)鍵的構(gòu)建細(xì)胞，它對于髓鞘的生成、營養(yǎng)神經(jīng)元和支持神經(jīng)結(jié)構(gòu)都起著至關(guān)重要的作用。已有研究表明，Gen可以改善糖尿病小鼠神經(jīng)生長因子含量和血管功能障礙〔10〕，還可以逆轉(zhuǎn)周圍神經(jīng)損傷后的疼痛過敏反應(yīng)，可能與Gen發(fā)揮其抗氧化性有關(guān)〔11〕。本研究說明37.000 μmol/L Gen減緩RSC96細(xì)胞生長；細(xì)胞周期抑制蛋白可能在抑制RSC96細(xì)胞生長方面發(fā)揮作用。研究報(bào)道Gen作為酪氨酸激酶抑制劑，對SCs增殖分化，髓鞘形成產(chǎn)生影響〔12,13〕，可見Gen對RSC96細(xì)胞的抑制作用通過多種途徑完成，并存在劑量依賴性。同時(shí)，本課題組還要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Gen能否對病理?xiàng)l件下氧化損傷的RSC96細(xì)胞有影響及其作用的相關(guān)濃度分析?？傊狙芯吭隗w外細(xì)胞水平闡明Gen能夠抑制大鼠SCs增殖，初步分析了其機(jī)制，對Gen的治療選擇及劑量應(yīng)用具有一定借鑒意義。