丁宇 王猛 韓楊 仲崇琦 包?；?吳丹 袁曉環(huán)

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病腎病(DKD)是一種長期、持續(xù)性高血糖所引發(fā)的慢性腎臟功能障礙疾病，其病理學(xué)變化為腎小球萎縮、彌漫性和結(jié)節(jié)性系膜擴張及腎小球基底膜增厚〔1，2〕。目前，DKD的發(fā)病機制有待完全闡明，越來越多的研究表明氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化在其進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。其中氧化應(yīng)激是DKD的開始，幾乎在所有類型的腎細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、管狀細(xì)胞和足細(xì)胞)中激活各種病理途徑；纖維化是DKD最基本和最顯著的特征，如果不加以控制，炎癥可能在腎纖維化發(fā)病和進(jìn)展中起核心作用〔3〕。臨床研究報道〔6〕，在DKD患者血漿中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6水平顯著升高〔4〕；在終末期腎病(ESRD)患者中，治療性血液透析和腹膜透析本身也會進(jìn)一步刺激炎癥反應(yīng)并增加IL-6的產(chǎn)生〔5〕。文獻(xiàn)報道，炎癥的誘導(dǎo)和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生過程涉及幾種信號傳導(dǎo)途徑，其中有細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑，核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB途徑。NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的基因表達(dá)，在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用。近年來，在細(xì)胞和分子水平上對DKD病因的深入研究，發(fā)現(xiàn)炎癥因子是一種重要的促進(jìn)生理病理變化的因素。本研究探討H8緩解高糖環(huán)境下人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)相關(guān)炎癥反應(yīng)和作用機制，可更好地了解DKD發(fā)生發(fā)展中炎癥機制的關(guān)鍵特征，有助于確定潛在藥物靶點，為設(shè)計新型的抗炎治療DKD藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 HK-2細(xì)胞株(美國sigma公司)。

1.2藥物與試劑 化合物H8(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心)；mRNA提取試劑盒(美國Omega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Roche公司)；IL-6抗體、IL-17抗體、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體、山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；NF-κB抗體、ERK抗體、磷酸化(p)-ERK抗體及β-actin抗體(cell signaling公司)；二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美國Roche公司)；SYBR Green(美國Origene公司)；脫脂奶粉(BioFROX公司)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液(Biosharp公司)。

1.3實驗儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；NanoDrop 2000(美國Thermo公司)；低溫高速離心機(美國Sigma公司)；Amersham imager 600超靈敏多功能成像儀(日本)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組 體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)于5% CO2，37℃的恒溫箱中，每隔2～3 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長80%～90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代，取生長對數(shù)期細(xì)胞分組實驗。實驗設(shè)5組：正常(Con)組、高糖(HG，33 mmol/L-D葡萄糖)組、低劑量H8(HG+5 μg/ml H8)組、中劑量H8(HG+10 μg/ml H8組)、高劑量H8(HG+15 μg/ml H8)組，同時培養(yǎng)48 h。

1.5HK-2細(xì)胞存活率測定 采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測H8對HK-2細(xì)胞存活率的影響。取生長對數(shù)期的細(xì)胞，以每孔4×103細(xì)胞接種于96孔板，按H8濃度(1、5、10、20、25、50 μg/ml)加入每個孔道，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT，37℃環(huán)境孵育4 h后終止，棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO，每孔150 μl)，低速搖床震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各孔吸光值(A)，計算各組細(xì)胞存活率。

1.6實時熒光定量PCR(qPCR)檢測IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的表達(dá) 將5組收集的細(xì)胞按照mRNA提取試劑盒提取總mRNA，按mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；qPCR體系為：SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，R引物1 μl、F引物1 μl，無酶水6 μl，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。每組設(shè)兩個復(fù)孔，測出各組基因的Ct值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算相對表達(dá)量，實驗重復(fù)獨立3次。TNF-α上游引物：5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′，下游引物：5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′；IL-6上游引物：5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游引物：5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；IL-17上游引物：5′-TGTCACTGCTACTGCTGCTGAG-3′，下游引物：5′-CCTTTTGGGATTGGTATTGGTA-3′，β-actin上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3，下游引物：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

1.7Western印跡檢測IL-6、IL-17、TNF-α、NF-κB、ERK、p-ERK的蛋白表達(dá) 收集5組細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法測定各組細(xì)胞蛋白濃度，每組加入5×上樣緩沖液煮10 min，蛋白上樣、凝膠電泳(120 V，1 h)、轉(zhuǎn)膜(150 mA，45 min)，根據(jù)蛋白大小截取聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4℃過夜，TBST洗膜3次后，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL顯色液曝光，用超靈敏多功能成像儀測定條帶灰度值，實驗獨立重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H8對HK-2細(xì)胞存活率的影響 與Con組HK-2細(xì)胞存活率〔(100.0±0.00)%〕比較，1、5、10、20、25、50 μg/ml H8處理48 h對HK-2細(xì)胞存活率〔(110.5±2.32)%、(110.9±4.99)%、(110.5±3.61)%、(108.3±5.98)%、(102.5±3.36)%、(102.4±5.16)%〕無明顯的作用，提示H8在1～50 μg/ml對HK-2細(xì)胞無明顯的毒副作用。

2.2H8在高糖環(huán)境下對HK-2細(xì)胞IL-6、TNF-α和IL-17 mRNA表達(dá)的影響 與Con組比較，HG組IL-6、TNF-α和IL-17 mRNA表達(dá)均顯著增加(均P<0.05)，與HG組比較，各劑量H8組IL-6、TNF-α和IL-17 mRNA表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，與低劑量H8 組比較，中、高劑量H8組IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，與中劑量H8組比較，高劑量H8組IL-6 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，高劑量H8組IL-17 mRNA表達(dá)水平顯著低于低、中劑量H8組(P<0.05)；見表1。

表1 H8對高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子mRNA的影響

2.3H8在高糖環(huán)境下對HK-2細(xì)胞的炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB p65、IL-17蛋白表達(dá)影響 與Con組比較，HG組TNF-α、IL-6、NF-κB p65、IL-17蛋白表達(dá)均顯著增加(均P<0.05)；與HG組比較，各劑量H8組TNF-α、IL-6、NF-κB p65、IL-17蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，與低劑量H8 組比較，高劑量H8組TNF-α、IL-17、NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)；與中劑量H8 組比較，高劑量H8 組TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 H8對高糖環(huán)境下 HK-2 細(xì)胞炎癥相關(guān)因子蛋白的影響

1～5:Con組、HG組、低劑量H8組、中劑量H8組、高劑量H8組；下圖同圖1 H8對高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子蛋白的影響

2.4H8在高糖環(huán)境下對HK-2細(xì)胞ERK信號通路蛋白的影響 與Con組(0.509±0.01)比較，HG組(1.204±0.05)p-ERK/ERK蛋白顯著增加(P<0.05)；與HG組比較，低、中、高劑量H8組〔(0.685±0.02)、(0.772±0.03)、(0.525±0.13)〕p-ERK/ERK蛋白顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 H8對高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞信號通路p-ERK蛋白的影響

3 討 論

近年來，由于肥胖人群數(shù)量的增加，2型糖尿病的患病率在全球范圍內(nèi)不斷上升〔7〕，并且約有25%的2型糖尿病患者會出現(xiàn)DKD的癥狀，因此DKD還是高收入國家導(dǎo)致ESRD的主要原因〔8〕。其發(fā)病機制是由多種因素共同作用，而高血糖，氧化應(yīng)激，晚期糖基化終產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ作為主導(dǎo)因素，每一個因素都可以激活NF-κB，這是控制一系列促炎基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子〔9～12〕。因此，上調(diào)促炎信號通路被認(rèn)為是導(dǎo)致DKD發(fā)生進(jìn)展的關(guān)鍵〔13〕。很多證據(jù)表明，高血糖可通過不同途徑產(chǎn)生過量的活性氧會導(dǎo)致下游分子的激活，如ERK、NF-κB和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等，并最終通過激活一系列不同的信號級聯(lián)導(dǎo)致DKD〔14，15〕。文獻(xiàn)證實，在糖尿病大鼠模型中p-ERK、NF-κB表達(dá)明顯增加，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，加速DKD的形成〔16〕。同樣地，在db/db糖尿病小鼠模型中，腎組織的NF-κB表達(dá)上調(diào)，增加了炎癥因子的釋放，介導(dǎo)了DKD的產(chǎn)生〔17〕。

文獻(xiàn)報道，ERK和NF-κB能緩解氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞死亡，可改善順鉑引起的腎毒性〔18〕。另有證據(jù)表明，在炎性細(xì)胞因子中，如TNF-α、IL-6等與DKD密切相關(guān)，其多種作用可能參與其他糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生〔19〕。本實驗也與文獻(xiàn)報道一致。而化合物H8能減少高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其機制有可能與抑制ERK信號通路有關(guān)。