郭麗 趙虹 張俊濤 劉志貞 弓韜 梁文婷 劉暢 孫公勤 于保鋒

(1臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所)

原發(fā)性肝癌是世界常見高發(fā)惡性腫瘤，進(jìn)展快、預(yù)后差，其治療方法包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，難治愈；探尋新的有效治療藥物及手段對(duì)肝癌治療有重要意義，分子靶向治療為肝癌的治療提供了新的手段〔1,2〕。microRNA(miR)是一類僅有20～24 nt核苷酸的小RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因，且可影響肝癌細(xì)胞的惡性病理過(guò)程〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-654-3p可能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲〔4〕。miR-654-5p通過(guò)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2調(diào)控人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)miR-654在肝癌中上調(diào)表達(dá)，但目前miR-654對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響還不清楚。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)定位于染色體3p14.2，是一個(gè)腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤及肝癌中表達(dá)減少和缺失〔6〕。研究報(bào)道過(guò)表達(dá)FHIT可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致其發(fā)生G1期阻滯從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-654和FHIT的抑制表達(dá)載體至肝癌細(xì)胞HepG2中，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞的影響；同時(shí)研究miR-654和FHIT之間的靶向關(guān)系，旨在研究miR-654對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制是否與FHIT有關(guān)。

1 材料與方法

1.1患者組織和肝癌細(xì)胞來(lái)源 選取山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西白求恩醫(yī)院收治的肝癌患者，手術(shù)取其肝癌組織和癌旁組織，所有患者術(shù)前未進(jìn)行放化療，均知情同意。肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自武漢益普生物公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、FHIT、GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)自上海代軒生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)AAT Bioquest公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 肝癌細(xì)胞HepG2用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將miR-654抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，計(jì)為anti-miR-654組、anti-miR-NC組；將miR-654抑制劑分別與FHIT干擾載體及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，計(jì)為anti-miR-654+si-FHIT組、anti-miR-654+si-NC組。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-654表達(dá)水平 取適量肝癌組織、癌旁組織及收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組的HepG2細(xì)胞，加入Trizol試劑提取其總RNA，合成cDNA后U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.3.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)，分別加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞后用結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸；然后加入Annexin V-FITC和PI，反應(yīng)后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值。

1.3.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 取anti-miR-NC組、anti-miR-654組、anti-miR-654+si-NC組、anti-miR-654+si-FHIT組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，再加入結(jié)晶紫染色，漂洗干燥，用顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)，即為遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)用基質(zhì)膠平鋪覆蓋Transwell上室，然后同遷移操作。

1.3.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將FHIT 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體(WT-FHIT和MUT-FHIT)分別與miR-NC和miR-654共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，依據(jù)說(shuō)明書要求操作，檢測(cè)熒光素酶活性。將anti-miR-NC、anti-miR-654、miR-NC、miR-654分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，用Western印跡檢測(cè)FHIT蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-654在肝癌組織中的表達(dá) 肝癌組織中miR-654表達(dá)水平(0.78±0.12)顯著高于癌旁組織(0.18±0.03，P<0.05)。

2.2抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-654后，anti-miR-654組miR-654的表達(dá)水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功；anti-miR-654組48及72 h細(xì)胞活性及CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平顯著低于anti-miR-NC組，而細(xì)胞凋亡率和p21、Bax表達(dá)水平顯著高于anti-miR-NC組(均P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2凋亡的影響

1～2：anti-miR-NC組，anti-miR-645組圖2 抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表1 抑制miR-654對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響

2.3抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2遷移、侵襲的影響 anti-miR-654組HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目、MMP-2表達(dá)水平均顯著低于anti-miR-NC組，而E-cadherin的表達(dá)水平顯著高于anti-miR-NC組(均P<0.05)，見圖3，表2。

1～2:anti-miR-NC組，anti-miR-654組圖3 抑制miR-654對(duì)遷移、侵襲蛋白E-cadherin和MMP-2表達(dá)的影響

表2 抑制miR-654對(duì)細(xì)胞遷移侵襲的影響

2.4miR-654靶向、調(diào)控FHIT TargetScan預(yù)測(cè)顯示FHIT與miR-654存在結(jié)合位點(diǎn)。見圖4。WT-FHIT與miR-654共轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于WT-FHIT與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05)，見表3。miR-654組FHIT表達(dá)水平(0.08±0.01)顯著低于miR-NC組(0.25±0.03，P<0.05)；anti-miR-654組FHIT表達(dá)水平(0.67±0.05)顯著高于anti-miR-NC組(0.23±0.02，P<0.05)。見圖5。

圖4 FHIT與miR-654的互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1,2：miR-NC組，miR-654組圖5 FHIT蛋白的表達(dá)水平

2.5抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的作用 anti-miR-654+si-FHIT組48及72 h細(xì)胞活性及CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平顯著高于anti-miR-654+si-NC組，而細(xì)胞凋亡率及FHIT、p21、Bax表達(dá)水平顯著低于anti-miR-654+si-NC組(均P<0.05)，見圖6、表4。

1，2：anti-miR-654+si-NC,anti-miR-654+si-FHIT組圖6 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-654對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的作用

2.6抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2遷移、侵襲的作用 anti-miR-654+si-FHIT組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目及MMP-2表達(dá)水平顯著高于anti-miR-654+si-NC組，E-cadherin表達(dá)水平顯著低于anti-miR-654+si-NC組(均P<0.05)，見表5、圖7。

表5 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-654對(duì)細(xì)胞遷移侵襲的作用

1～2:anti-miR-654+si-NC組,anti-miR-654+si-FHIT組圖7 抑制FHIT和miR-654對(duì)細(xì)胞HepG2遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌有惡性程度高、起病隱匿、進(jìn)展快等特點(diǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為診斷、預(yù)后的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)〔9，10〕。有研究報(bào)道m(xù)iR-654-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，其低表達(dá)與晚期TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-654-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向上皮基質(zhì)相互作用(EPSTI)1基因抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡〔11〕。miR-654-5p在晚期口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者中上調(diào)并且與OSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)；可促進(jìn)OSCC的增殖，轉(zhuǎn)移〔12〕。本研究結(jié)果表明抑制miR-654可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

CyclinD1和p21均是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，CyclinD1高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，p21是抑癌基因，可抑制細(xì)胞的異常生長(zhǎng)〔13〕。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bax促凋亡，Bcl-2抑凋亡。E-cadherin主要維持細(xì)胞間的黏附作用，其下調(diào)表達(dá)細(xì)胞間黏附性降低；MMP-2與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明抑制miR-654表達(dá)可通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

目前，F(xiàn)HIT廣泛被認(rèn)為是一種抑癌基因蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖，異常低表達(dá)與多種腫瘤進(jìn)展相關(guān)〔15〕。FHIT在原發(fā)性肝癌中低表達(dá)，參與了肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)控過(guò)程〔16〕。轉(zhuǎn)染FHIT可增強(qiáng)人肝癌細(xì)胞HepG2輻射敏感性〔17〕。FHIT還可誘導(dǎo)肺癌自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔18〕。

綜上，抑制miR-654表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控FHIT表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。