劉亞群 王布 孔文杰 張秀瓏 張志華

(河北北方學院 1附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，河北 張家口 075000；2研究生部)

肺癌是嚴重危害人類生命健康的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年公布的資料顯示，肺癌是世界上最常見和最致命的惡性腫瘤之一，僅2018年一年就新增1 810萬病例，死亡人數(shù)高達960萬，5年生存率僅為15.8%,其中非小細胞肺癌(NSCLC)患者約占所有肺癌總數(shù)的80%，超過50%的肺癌患者被診斷出NSCLC有遠處轉移，整體預后差，約2/3的患者確診時已無手術機會〔1〕。要改善肺癌患者生存率，需要依靠規(guī)范有序的診斷、分期及根據(jù)其臨床行為制訂多學科治療方案。隨著科學的不斷進步和人類的探索發(fā)現(xiàn)：微小RNA(miRNA)是一種內源性小分子單鏈RNA，由19～24個核苷酸組成〔2〕。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-320a在肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病關系密切〔3〕。關于miR-320a與血管內皮生長因子(VEGF)與肺癌發(fā)病關系，目前相關研究文獻較少。本研究旨在探討肺癌患者血清中miR-320a與VEGF的表達關系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1標本收集 2017年9月至2019年6月河北北方學院附屬第一醫(yī)院入院患者中通過胸腔鏡活檢、電子支氣管鏡、肺穿刺活檢確診肺癌患者93例，納入標準：①符合國際肺癌研究協(xié)會制定的肺癌臨床診斷；②預計生存期>3個月，體能狀態(tài)評分標準(ECOG-PS)評分為0～2分；③經病理學或細胞學確診，且經CT檢查證實至少存在1處可測量病灶；④心肝腎等重要臟器功能無重大損傷，功能基本正常，無嚴重感染；⑤骨髓儲備正常；排除標準：①預計生存期<3個月；②心肝腎等重要臟器功能存在嚴重障礙者，合并未控制的嚴重感染；③未找到可供測量的或評價的實體瘤；④骨髓造血功能異常；年齡46～78歲，并于同期收集93例健康體檢者設為正常健康組。本實驗研究均經過患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測血清miR-320a表達量 入院病人于清晨6點空腹抽取靜脈血4 ml，所取標本立即于離心機以3 500 r/min離心5 min，分離上層血漿并保存于-80℃冰箱。按cDNA合成試劑盒(購自北京天根生化科技公司)進行反轉錄。反應條件:42℃ 60 min;95℃ 3 min;產物cDNA置于-20℃冰箱保存。以cel-miR-39為外參。miR-320a的逆轉錄引物的正向引物(5′-3′)為 TATTCGCACTGGATACGACTCCAGC，反向引物 (5′-3′) 為 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG。外參引物購自天根生化(目錄號：CD200-01)。每組各取200 μl血清，采用天根DP501柱提法提取血清中小于200 nt RNA，TGem微量分光光度計測量RNA的純度和濃度。采用定量PCR試劑盒FP411進行Real-time PCR 反應，反應條件:95 ℃ 15 min,94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5個循環(huán)；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算 miR-320a相對表達量。

1.3血清中VEGF檢測 入院病人于清晨6點空腹抽取靜脈血4 ml，所取標本立即于離心機以3 500 r/min離心5 min，分離上層血漿并保存于-80℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中VEGF，其中VEGF檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；使用由美國Molecular Devices生產的酶標儀進行檢測，在酶標儀波長為450 nm處測定OD值，并應用軟件繪制標準曲線對應的濃度值，測定方法嚴格按照人VEGF ELISA試劑盒說明書規(guī)范操作。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關分析，采用受試者工作特征曲線面積(AUC)評估血清miR-320a、VEGF對肺癌診斷的靈敏度及特異度。

2 結 果

2.1兩組血清中miR-320a與VEGF表達 肺癌組血清中miR-320a表達濃度顯著低于正常健康組。VEGF肺癌血清中表達顯著高于正常健康組(P<0.05)，見表1。

表1 肺癌組和正常組血清miR-320a、VEGF濃度

2.2肺癌患者血清中miR-320a、VEGF表達與患者臨床病理特征關系 肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達與TNM分期、分化程度、有無淋巴結轉移、癌胚抗原(CEA)高低均有關(P均<0.05)。肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達與患者性別、腫瘤病理類型、年齡無關(P>0.05)。見表2。

表2 肺癌患者血清中miR-320a表達、VEGF水平與患者臨床病理學特征的關系

2.3肺癌患者血清中miR-320a與VEGF相關性 肺癌患者血清中miR-320a與VEGF呈顯著負相關(r=-0.753，P<0.05)。

2.4血清中miR-320a、VEGF對肺癌患者的診斷價值評價 根據(jù)肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達含量繪制ROC曲線(圖1)，并確定miR-320a、VEGF的診斷界值分別為miR-320a=1.63、VEGF=233.88 pg/ml，為診斷界值。血清miR-320a、VEGF聯(lián)合檢測對肺癌的診斷價值最高，AUC為0.969(95%CI：0.948～0.991)，靈敏度、特異度分別為0.903、0.946。見表3。

圖1 血清中miR-320a、VEGF診斷肺癌的ROC曲線

表3 miR-320a與VEGF對肺癌的診斷價值

3 討 論

mirRNA是一種內源性小分子單鏈RNA，由19～24個核苷酸構成的。隨著人類的不斷探索，人類對miRNA的探索取得階段性成果，人類發(fā)現(xiàn)miRNA在多種惡性腫瘤中高度表達，對腫瘤的浸潤、轉移、侵襲力都有不同程度的影響，其次miRNA對生存及預后及生存期都有巨大的影響〔4〕。miR-320a是miRNA家族中重要的成員之一，參與多種腫瘤的表達。miR-320a通過調節(jié)不同的信號通路在腫瘤中的表達，如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、Wnt、信號轉導子和轉錄激活子(STAT)3、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，從而發(fā)揮促癌或者抑癌的作用〔5〕。有研究報道m(xù)iR-320a在腫瘤中(如肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌)表達水平升高或者降低而發(fā)揮癌基因的作用〔6〕。本研究提示miR-320a可能參與了腫瘤的浸潤、轉移以及侵襲，對肺癌的診斷及治療有一定的指導意義。

VEGF又稱為血管通透因子，是一系列參與信號傳導的糖蛋白，在體外可促進血管內皮細胞的生長，在體內可誘導血管增生,其通過增加血管通透性，使血管內纖維蛋白原等血漿蛋白外滲，纖維蛋白原與血管外滲纖維連接蛋白等多種成分凝結形成交叉的纖維蛋白凝膠體，為內皮細胞、成纖維細胞的遷移提供一個纖維網絡，有利于血管生成〔7〕。其次VEGF及其受體在腫瘤組織中的高水平表達與多種腫瘤的預后不良有關,這些腫瘤包括星形膠質細胞瘤、肺癌、結腸癌、膀胱癌、頭頸鱗癌、肝癌等〔8〕。腫瘤血管是腫瘤生長和浸潤、轉移的形態(tài)學基礎，其不僅向腫瘤組織提供豐富的營養(yǎng)，也向腫瘤宿主輸出大量腫瘤細胞，導致腫瘤的擴散和轉移〔9〕。本研究結果表明VEGF是肺癌較好的腫瘤標志物，對肺癌診斷及治療有一定的指導意義。

本研究提示miR-320a與VEGF可能存在負反饋作用，同過共同的傳導通路發(fā)揮協(xié)同作用，促進血管生成，并加速腫瘤的浸潤、侵襲及轉移〔10〕。

本研究結果表明通過聯(lián)合檢測可在很大程度上降低誤診率和漏診率，對肺癌患者早期診斷提供重要的參考價值。

綜上，miR-320a與VEGF的聯(lián)合檢測有望從理論走向臨床應用，為腫瘤的病情判斷、早期診斷、治療開辟一條新的途徑〔11〕。