古聯(lián) 陳卓 梁琳梅 朱路路 周文君 龍建雄 蘇莉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2研究生院；3廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

缺血性腦卒中(IS)在中醫(yī)學(xué)中可歸屬于“中風(fēng)”范疇。遺傳因素與環(huán)境因素共同作用促使發(fā)生IS，其中遺傳因素在 IS 的病變過(guò)程中起著不可或缺的作用〔1〕。IS的中醫(yī)證候是對(duì)該病某個(gè)階段或某個(gè)類(lèi)型的病理概括，根據(jù)其不同臨床特點(diǎn)可辨證分為數(shù)個(gè)證候。研究表明組學(xué)相關(guān)研究可揭示中醫(yī)證候的內(nèi)在分子基礎(chǔ)，其中基因遺傳多態(tài)性可能是中醫(yī)證候的微觀生物學(xué)標(biāo)志，其影響個(gè)體疾病的差異表現(xiàn)，兩者關(guān)系密切〔2〕。WD重復(fù)域(WDR)5B基因編碼含有數(shù)個(gè)WD40重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，WD40重復(fù)序列蛋白家族在信號(hào)傳導(dǎo)、mRNA加工、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔3〕。目前發(fā)現(xiàn)多種人類(lèi)疾病與該重復(fù)蛋白家族基因突變相關(guān)〔4〕。在神經(jīng)研究方面，也已報(bào)道多種WD40重復(fù)序列家族蛋白與氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、神經(jīng)再生相關(guān)〔5，6〕?，F(xiàn)暫未見(jiàn)IS及其中醫(yī)證候與WDR5B基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究報(bào)告。本研究就IS各中醫(yī)證候及臨床表型與WDR5B基因rs9843165多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行病例-對(duì)照研究，以探討IS患者中醫(yī)證候的發(fā)生發(fā)展是否具有一定基因遺傳特征及臨床表型相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 本研究共納入IS患者774例，對(duì)照組793例。以廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科(一區(qū)、二區(qū))為病例組納入點(diǎn)，收集兩個(gè)區(qū)2015～2019年收治的IS住院病例。選擇同時(shí)期該院及社區(qū)體檢中心的參加健康體檢者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病例組：①需符合中醫(yī)診斷及西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)疾病診斷依照國(guó)家中醫(yī)藥管理局制訂的《中風(fēng)病診斷與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》中的IS的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕；西醫(yī)診斷參照第四次全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類(lèi)腦血管疾病診斷要點(diǎn)》其中的IS的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕；本研究?jī)?nèi)IS證候診斷則采用國(guó)家中管局制定的《中風(fēng)病辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》〔9〕。②起病均為72 h之內(nèi)的急性期IS患者。③所有患者行頭顱CT和(或)頭顱磁共振成像(MRI)+磁共振彌散成像(DWI)檢查以明確診斷。對(duì)照組：應(yīng)為一般正常人，既往不存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史或家族史者；年齡和性別分布與本研究中的病例組有可比性?；颊咦晕覉?bào)告為中國(guó)漢族人群，研究對(duì)象之間均無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn):病例組：①短暫性腦缺血發(fā)作、腦血管畸形、血液系統(tǒng)疾病及藥物等其他因素引起的IS；②嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重肝腎功能不全、合并有感染性疾病或嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病的患者；③不依從者。對(duì)照組：①伴有嚴(yán)重心臟、肝臟或腎臟疾病者；②有自身免疫系統(tǒng)疾病者，或正在使用免疫抑制劑或激素者。對(duì)照組女356 例，男437例，平均年齡(63.81±10.36)歲。病例組女315例，男459例，平均年齡(64.12±10.34)歲。兩組性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.815，P=0.093)，兩組平均年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.582，P=0.561)，具有可比性。病例組行中醫(yī)辨證，風(fēng)證315例、火熱證86 例、痰證346例、血瘀證173例、氣虛證88例、陰虛陽(yáng)亢證17例(各證之間有重疊)。本研究標(biāo)陰虛陽(yáng)亢證樣本量過(guò)少，故后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析不計(jì)入該證候病例。

1.2研究方法

1.2.1中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 采用國(guó)家中醫(yī)藥管理局制定的《中風(fēng)病辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》對(duì)IS患者進(jìn)行辨證及證候賦分。該標(biāo)準(zhǔn)綜合了中醫(yī)診斷要素，如起病緩急、臨床特點(diǎn)、二便情況、舌脈象等，將IS精簡(jiǎn)概括為6個(gè)具有臨床代表性的證候，包括風(fēng)證、火熱證、痰證、瘀血證、氣虛證、陰虛陽(yáng)亢證，同時(shí)賦分，分?jǐn)?shù)≥7分則該證候診斷成立，分值越高則該證候特征越明顯。所有病例組均經(jīng)2名主治醫(yī)師以上職稱的中醫(yī)師根據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)四診合參進(jìn)行辨證，若2名中醫(yī)醫(yī)師對(duì)同一患者的證候辨證結(jié)果不一致，即提交至副主任醫(yī)師以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師確定證候評(píng)分。所有研究的對(duì)象知情同意并簽訂同意書(shū)。研究方案已通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意。

1.2.2基因分型檢測(cè) 采集受試者2 ml的清晨空腹外周靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，采用血液基因組 DNA 提取試劑盒 (北京天根科技有限公司)，依說(shuō)明書(shū)提取研究對(duì)象血液樣本的基因組DNA。使用1.25%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的擴(kuò)增片段后以進(jìn)行DNA質(zhì)檢，同時(shí)進(jìn)行OD值檢測(cè)，質(zhì)檢合格的DNA即轉(zhuǎn)移至-80℃的低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)及合成交由生物公司完成。第一引物序列：5′-ACGTTGGATGCCGTAACCTCACACATTAAC-3′；第二引物序列：5′-ACGTTGGATGGCGTGTTTATCATGTCTCCG-3′。利用 Sequenom 基因分型平臺(tái)對(duì)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)。

1.2.3收集指標(biāo) ①一般指標(biāo)：年齡、性別、民族。②臨床指標(biāo)：活化部分凝血酶原時(shí)間 (APTT)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)、凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶原時(shí)間活動(dòng)度(PTA)、血小板(PLT)、載脂蛋白A1(apo-A)、apo-B、總膽固醇(TC)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、同型半胱氨酸(Hcy)等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用PLINK軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、非條件 Logistic回歸模型分析、Linear回歸分析。上述關(guān)聯(lián)分析均采用加性模型、隱性模型、顯性遺傳模型進(jìn)行。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點(diǎn)的哈溫平衡檢驗(yàn)及基因型頻率分布比較 對(duì)照組WDR5B基因rs9843165位點(diǎn)基因型頻率分布Hardyweinberg平衡(P=0.114)，本研究所涉及的樣本具有群體代表性。IS各病例證候組(風(fēng)證組、火熱證組、痰證組、血瘀證組、氣虛證組)與對(duì)照組之間的基因型頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。見(jiàn)表1。

表1 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布比較(n)

2.2WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS易感性的關(guān)聯(lián) 在校正性別年齡前，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與 IS 易感性的關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔加性模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，P=0.459；顯性模型：OR(95%CI)=1.03(0.84～1.25)，P=0.801；隱性模型：OR(95%CI)=1.24(0.88～1.75)，P=0.226；等位基因模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.23)，P=0.468〕；在校正性別年齡后，該基因多態(tài)性與IS易感性的關(guān)聯(lián)亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔加性模型：ORadj(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，Padj=0.431；顯性模型：ORadj(95%CI)=1.03(0.85～1.26)，Padj=0.742；隱性模型：ORadj(95%CI)=1.23(0.87～1.74)，Padj=0.236〕。

2.3WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián) 在隱性模型中(CC vs CG+GG)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS火熱證發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔隱性模型：OR(95%CI)= 1.93(1.02～3.67)，P=0.044〕，而與其他四個(gè)證候未見(jiàn)明顯關(guān)聯(lián)性，見(jiàn)表2；在校正年齡、性別后，該位點(diǎn)與火熱證的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)〔隱性模型：ORadj(95%CI)=1.93(1.01～3.67)，Padj=0.046〕，見(jiàn)表3。

表2 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

表3 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)在校正后的關(guān)聯(lián)

2.4WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的凝血標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性 在加性模型中(CC vs GG)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的D-D水平的關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔加性模型：β(95%CI)=0.28(0.02～0.54)，P=0.034〕；在隱性模型(CC vs CG+GG)分析中，該位點(diǎn)多態(tài)性與IS患者的D-D水平顯著相關(guān)〔隱性模型：β(95%CI)=0.83(0.26～1.39)，P=0.004〕，而WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者在其他表型間的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者凝血標(biāo)志物的相關(guān)分析

2.5WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血脂水平的關(guān)聯(lián)性 對(duì)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血脂水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的VLDL水平的關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔加性模型：β(95%CI)=-0.05(-0.10～0.00)，P=0.042〕，該位點(diǎn)多態(tài)性與IS患者的TG水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)〔加性模型：β(95%CI)=-0.21(-0.42～0.00)，P=0.049〕，見(jiàn)表5。

表5 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者血脂水平的相關(guān)分析

2.6WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者Hcy水平的相關(guān)分析 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者血漿Hcy水平顯著相關(guān)〔加性模型：β(95%CI)=-0.78(-1.38～-0.17)，P=0.012；隱性模型：β(95%CI)=-1.83(-3.13～-0.53)，P=0.006〕；校正性別、年齡后分析，兩者仍具有顯著關(guān)聯(lián)〔加性模型：β(95%CI)=-0.79(-1.38～-0.21)，P=0.008；隱性模型：β(95%CI)=-2.07(-3.32～-0.81)，P=0.001〕。

3 討 論

中醫(yī)診斷思維過(guò)程的核心內(nèi)容是“辨證”，所言之“證”即“證候”，是以臨床四診證據(jù)為基礎(chǔ)對(duì)疾病某一階段病機(jī)、病性、病位的高度概括。以此為基礎(chǔ)，疾病不同階段的病機(jī)病變特點(diǎn)則表現(xiàn)出不同的證候，可稱為“同病異證”，如IS在臨床可分為風(fēng)證、火熱證、痰瘀證等數(shù)個(gè)證候。此外，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，IS根據(jù)病因特點(diǎn)可分為大動(dòng)脈粥樣硬化型、小動(dòng)脈閉塞型、心源性栓塞型等病變類(lèi)型，體現(xiàn)出疾病的異質(zhì)性?？梢园l(fā)現(xiàn)中醫(yī)證候理論中的同病異證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疾病異質(zhì)性存在相契合點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IS是基因和環(huán)境共同作用而發(fā)生的，不同基因通過(guò)對(duì)蛋白調(diào)控及表達(dá)，可反映出不同臨床類(lèi)型，相關(guān)研究已表明臨床亞型的表現(xiàn)有分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)〔10〕。相似地，有學(xué)者認(rèn)為基因多態(tài)性可作為中醫(yī)證候的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，兩者有著緊密的關(guān)聯(lián)〔2〕。吳天敏等〔11〕關(guān)于2型糖尿病的研究同樣發(fā)現(xiàn)基因遺傳多態(tài)性與中醫(yī)證候的密切聯(lián)系，該研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2基因rs7903146多態(tài)性T等位基因可能與2型糖尿病痰熱互結(jié)證的發(fā)生相關(guān)，而與該研究其他中醫(yī)證候無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。一項(xiàng)糖尿病的研究報(bào)告〔12〕，研究者對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-6基因rs1800796多態(tài)性與高血壓中醫(yī)證型進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究并發(fā)現(xiàn)基因與證候間存在陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)GC型可能為高血壓痰瘀互結(jié)型的風(fēng)險(xiǎn)基因型，而在其他證型間未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果提示該多態(tài)性位點(diǎn)可能作為IS火熱證的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。上述研究均不同程度提示中醫(yī)證候具有分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)中醫(yī)的證候本質(zhì)研究起一定促進(jìn)作用。

WD重復(fù)域(WDR)5B基因編碼WD40重復(fù)序列蛋白，該蛋白家族功能復(fù)雜、結(jié)構(gòu)保守，在信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用〔13〕。目前已有研究發(fā)現(xiàn)〔6〕，該蛋白家族成員通過(guò)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激及細(xì)胞損傷在腦缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到相應(yīng)作用。近期一項(xiàng)關(guān)于冠心病的研究〔14〕提示，WD40重復(fù)蛋白家族成員WDR35基因通過(guò)磷酸化途徑調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能最終參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程的調(diào)控。上述研究均提示W(wǎng)D40重復(fù)序列蛋白可能通過(guò)不同途徑參與心腦血管病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。雖本研究發(fā)現(xiàn)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)尚無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，但本研究發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與IS火熱證發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該位點(diǎn)多態(tài)性可能是IS火熱證病變的影響因素。IS火熱證多出現(xiàn)于急性期，本研究病例組均為急性期IS患者，金代醫(yī)家劉河間強(qiáng)調(diào)火熱致病，指出火熱在IS的病變過(guò)程中的突出作用。IS火熱病邪致病與肝、心、胃等臟腑的關(guān)系緊密，IS病變之火熱起于心肝，而實(shí)于胃腸。心屬火，心陽(yáng)亢盛則表現(xiàn)為火熱；肝主升發(fā)，氣機(jī)不暢則可郁而化生火熱；陽(yáng)明之胃多氣多血，食入肥甘厚膩易致陽(yáng)明火熱內(nèi)生?；馃釣椴∨R床表現(xiàn)多急，火熱之邪閉塞清竅、擾亂神明，患者出現(xiàn)IS基本癥狀之外常伴舌紅或絳、苔黃或燥、神煩或易怒、氣粗或口干、脈弦數(shù)或滑數(shù)?！端貑?wèn)·至真要大論》言“諸熱瞀瘛，皆屬于火”及出自《素問(wèn)·生氣通天論》關(guān)于怒火引發(fā)IS的說(shuō)法“大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，均說(shuō)明火熱導(dǎo)致IS的重要特點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的D-D水平的具有顯著關(guān)聯(lián)。D-D作為血栓形成及纖溶反應(yīng)的標(biāo)志物參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展過(guò)程中，與IS關(guān)系密切〔15〕，WDR5B基因多態(tài)性則可能通過(guò)影響D-D代謝進(jìn)而參與IS病變過(guò)程中。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的VLDL水平的關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與WD重復(fù)蛋白家族影響氧化應(yīng)激有關(guān)。血脂及凝血功能的異常是IS發(fā)生及演變的風(fēng)險(xiǎn)因素，與本研究相似的是，研究發(fā)現(xiàn)MRAS多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與IS血脂TC水平升高相關(guān)〔16〕。此外，我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在校正性別年齡前或校正性別年齡后，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血漿Hcy水平均顯著相關(guān)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19基因多態(tài)性與IS的凝血功能及Hcy水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，提示該基因多態(tài)性可能影響IS患者的凝血功能及Hcy代謝〔17〕。Hcy參與腦缺血后損傷的過(guò)程，其介導(dǎo)機(jī)制包括氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)等，其已被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)是IS的危險(xiǎn)因子之一〔18，19〕。綜上，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性可能通過(guò)影響患者的血脂、凝血功能及Hcy水平進(jìn)而影響IS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但其具體影響機(jī)制需深入研究。