馮婷，鐘勇，楊瑞，楊立，陶昆蓉，劉競(jìng)鷗，戶美玲，嚴(yán)東珍

（成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023）

過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide）是一種無(wú)機(jī)化合物，化學(xué)式H2O2。過(guò)氧化氫液體可與水任意比例混溶，是一種強(qiáng)氧化劑，水溶液俗稱雙氧水，為無(wú)色透明液體，在一般情況下會(huì)緩慢分解成水和氧氣[1]。VHP 生物滅菌技術(shù)于20 世紀(jì)末前后提出，是一種在常溫狀態(tài)下將液態(tài)過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)換成氣態(tài)過(guò)氧化氫進(jìn)行滅菌消毒的技術(shù)。有實(shí)驗(yàn)證明，與殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子相比，汽化過(guò)氧化氫滅菌更容易殺滅枯草芽孢桿菌亞種孢子[1]。該技術(shù)目前已被應(yīng)用于無(wú)菌隔離器、廠房滅菌等領(lǐng)域?？臻g滅菌的原理和特點(diǎn)為：過(guò)氧化氫液體在高溫下瞬間快速蒸發(fā)為蒸汽，這些過(guò)氧化氫蒸汽被氣流送入滅菌環(huán)境，生成游離的氫氧基，通過(guò)進(jìn)攻細(xì)胞成分，如脂類、蛋白質(zhì)和DNA，從而破壞微生物組織，更具高效、快速、無(wú)毒、無(wú)殘留的優(yōu)越性[2]。鑒于上述特點(diǎn)，將VHP 滅菌技術(shù)用于疫苗無(wú)菌檢查樣品、器皿的外表面滅菌中，可以提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 VHP 簡(jiǎn)介

VHP 傳遞窗主要由傳遞窗箱體、新風(fēng)系統(tǒng)、排風(fēng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、過(guò)氧化氫滅菌系統(tǒng)電氣控制系統(tǒng)組成。雙扉門結(jié)構(gòu)從低潔凈等級(jí)區(qū)域（D 級(jí)）向高潔凈等級(jí)區(qū)域（B 級(jí)）傳遞物品時(shí)，設(shè)備啟動(dòng)VHP 滅菌程序，實(shí)現(xiàn)VHP 滅菌的功能，完成窗體內(nèi)滅菌及傳遞；從高潔凈等級(jí)區(qū)域（B 級(jí)）向低潔凈等級(jí)區(qū)域（D 級(jí)）傳遞物品時(shí)，該傳遞窗可實(shí)現(xiàn)普通傳遞窗的功能。檢驗(yàn)區(qū)D 級(jí)和B 級(jí)外部區(qū)域設(shè)有操作界面，配有轉(zhuǎn)移車和貨架，內(nèi)部有垂直層流裝置，上部有出風(fēng)口，下部有測(cè)回風(fēng)，送、排風(fēng)的高效過(guò)濾效率≥99.995%（＞0.3 μm）。傳遞窗門與箱體間采用充氣密封方式密封，應(yīng)確保在滅菌時(shí)房間的過(guò)氧化氫濃度低于1 mg/L 的安全限定值，門采用不銹鋼邊框加鋼化玻璃視窗結(jié)構(gòu)，便于滅菌過(guò)程中對(duì)傳遞窗內(nèi)部進(jìn)行觀察[3]。

1.2 主要材料

1.2.1 樣品

乙型腦炎減毒活疫苗及無(wú)菌檢查相關(guān)用具。

1.2.2 試劑與器具

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FT）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂（TSA）均在培養(yǎng)基室制備，滅菌及適用性檢查均符合2020 版《中國(guó)藥典》的要求；培養(yǎng)皿（直徑90 mm）、血漿瓶、TSA（L-80）接觸碟（直徑55 mm）。

1.2.3 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]，來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.2.3 設(shè)備

BHC-1000DA2 型生物安全柜，浙江泰林；HTY-601 型電腦集菌儀，浙江泰林；CN330 型集菌培養(yǎng)器浙江泰林 ；孵室，20 ～25 ℃、30 ～35 ℃，成建。

1.3 研究方法

1.3.1 準(zhǔn)備（參數(shù)設(shè)定和最大裝量設(shè)置）

將VHP 傳遞窗參數(shù)設(shè)為固定參數(shù)：濕度40%RH，調(diào)節(jié)階段調(diào)節(jié)流量3.0 g/min，時(shí)間30 min；滅菌階段滅菌流量2.5 g/min，滅菌時(shí)間40 min；通風(fēng)時(shí)間90 min

最大裝載設(shè)置如圖1所示。第一層：集菌杯50套、供試品400支（西林瓶）；第二層：工具箱4箱；第三層：供試品45 瓶（250 mL 血漿瓶）、蛋白胨溶液30 瓶（250 mL 血漿瓶）；第四層：消毒液桶2 個(gè)、培養(yǎng)基140 瓶（250 mL 血漿瓶）、培養(yǎng)基中試管500 支（置于試管架上）。

圖1 最大裝載示意圖

1.3.2 密閉性測(cè)試

進(jìn)入測(cè)試界面，開啟壓力測(cè)試，艙體自動(dòng)充氣使壓力上升至100 Pa 以上，穩(wěn)定120 s 后自動(dòng)測(cè)試128 s，小時(shí)泄露率Q/V≤0.5%[小時(shí)泄露率=60×（起始絕對(duì)壓力-結(jié)束時(shí)的絕對(duì)壓力）/（起始絕對(duì)壓力×壓力下降時(shí)間均值]，系統(tǒng)自動(dòng)判定結(jié)果。

1.3.3 過(guò)氧化氫氣體分布測(cè)試

每層貨架分布6 張過(guò)氧化氫指示劑（分別擺在4 個(gè)角和中間左右位置），在過(guò)氧化氫滅菌過(guò)程中觀察每張過(guò)氧化氫指示劑的變色情況。

1.3.4 BI 挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)

將芽孢含量大于106的滅菌生物指示劑每層貨架分布6 張（分別擺在4 個(gè)角和中間左右位置），經(jīng)VHP 滅菌后再進(jìn)行培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.3.5 培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)

1.3.5.1 菌懸液制備

取金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌菌種接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面上，30 ～35 ℃下培養(yǎng)18 ～24 h；取白色念珠球菌菌種接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20 ～25 ℃下培養(yǎng)24 ～48 h；取生孢梭菌菌種接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基上，30 ～35 ℃下培養(yǎng)18 ～24 h；取上述培養(yǎng)物，采用10 倍稀釋法，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL 含菌落數(shù)不大于100 CFU 的菌懸液。取黑曲霉菌種接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20 ～25 ℃培養(yǎng)7 d，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL 含菌落數(shù)不大于100 CFU 的孢子菌懸液。

1.3.5.2 菌落計(jì)數(shù)

將滅菌后的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和100 CFU 陽(yáng)性對(duì)照菌密閉好，再進(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 密閉性測(cè)試

小時(shí)泄露率Q/V≤0.5%，系統(tǒng)自動(dòng)判定艙體密封性測(cè)試合格。

2.2 過(guò)氧化氫分布測(cè)試

開啟滅菌程序后，全程觀察，每隔2 min 記錄一次過(guò)氧化氫濃度讀數(shù)及相對(duì)濕度讀數(shù)。運(yùn)行全部結(jié)束后開門觀察：過(guò)氧化氫化學(xué)指示劑肉眼可見均由綠色變?yōu)榱它S色，過(guò)氧化氫氣體狀態(tài)分布合格。

表1 過(guò)氧化氫分布測(cè)試結(jié)果

2.3 BI 挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)

滅菌后取出生物指示劑送至37 ℃培養(yǎng)，第一次培養(yǎng)24 h 后觀察，培養(yǎng)液顏色均保持不變，再經(jīng)24 h培養(yǎng)后進(jìn)行第二次觀察，培養(yǎng)液顏色仍保持不變（陽(yáng)性對(duì)照的生物指示劑顏色培養(yǎng)后顏色由綠色變?yōu)辄S色），BI 挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)合格。

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將滅菌后的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在生物安全柜中灌入集菌杯，密封且熏蒸后的100 CFU 陽(yáng)性對(duì)照菌（金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌）一起轉(zhuǎn)至陽(yáng)性區(qū)，然后硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基接種陽(yáng)性對(duì)照菌（生孢梭菌、銅綠假單胞菌）胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基接種陽(yáng)性對(duì)照菌（白色念珠菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基接種陽(yáng)性對(duì)照菌（黑曲霉）作為陽(yáng)性參照。接種之前將陽(yáng)性菌在無(wú)菌隔離器內(nèi)暴露5 min 后進(jìn)行接種，接種完成后將接有菌種的培養(yǎng)基放置在無(wú)菌隔離器中，待性能驗(yàn)證完成后將其取出，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基放置20 ～25 ℃孵室和30 ～35 ℃孵室各一份培養(yǎng)3 d；胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基放置20 ～25 ℃孵室培養(yǎng)5 d。如表3 所示，培養(yǎng)后的陽(yáng)性菌均生長(zhǎng)良好（陰性對(duì)照未長(zhǎng)菌），VHP 滅菌后培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)合格。

表2 BI 挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

表3 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

VHP 空間滅菌技術(shù)符合GMP 要求，達(dá)到送檢樣品和器具外表面消毒的目的，同時(shí)避免了人工外表面消毒帶來(lái)清潔效果不統(tǒng)一、不徹底等問(wèn)題。由于其具有高效、無(wú)毒無(wú)殘留、滅菌效果標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、效果可驗(yàn)證等優(yōu)越性，因此能夠?yàn)樯a(chǎn)檢定帶來(lái)技術(shù)保證，并提高質(zhì)量檢定的可靠性。