田存章，賀新平，曹樂(lè)樂(lè)，謝一鳴，姬國(guó)杰，萬(wàn)嘉欣

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）作為我國(guó)常見中藥材，具有抗菌消炎、清熱解毒、保肝利膽等功效[1]，主要種植于山東、河南、廣東等地。金銀花葉作為金銀花的附屬產(chǎn)物，產(chǎn)量高且采集便利，卻一直未被充分合理利用。研究資料表明，金銀花葉中富含多種黃酮類化合物，具有抑菌、抗氧化、抗病毒等多種生物藥理活性作用，在食品、藥品、化妝品和保健品行業(yè)具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景[2-4]。當(dāng)前，植物天然生物活性成分藥理作用研究越來(lái)越受到重視[5]，本研究旨在探究金銀花葉總黃酮的最佳提取方法及其抗氧化能力，以期為金銀花資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金銀花葉采集于河南省封丘縣。

1.2 試劑與儀器

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201811），中國(guó)食品藥品檢定研究院；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二銨鹽（ABTS），Macklin 公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

T6 新世紀(jì)紫外可見光光度計(jì)，寧波歐普儀器有限公司；101 型號(hào)電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；R-206D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；MS105 電子分析天平，梅特勒公司。

1.3 金銀花葉總黃酮的提取

1.3.1 回流提取法

稱取金銀花葉粉末2.0 g 至150 mL 燒瓶中，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，加熱回流提取3 次，每次2 h，過(guò)濾，合并過(guò)濾液。

1.3.2 索氏提取法

稱取金銀花葉粉末2.0 g，用濾紙包好放入抽提筒中，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，加熱索氏提取3 次，每次2 h，合并過(guò)濾液。

1.3.3 超聲輔助浸提法

稱取金銀花葉粉末2.0 g，按1 ∶20（g ∶mL）的料液比加70%乙醇溶液，50 ℃條件下，超聲功率250 W、提取溫度50℃、超聲時(shí)間40 min，提取3 次，過(guò)濾，合并過(guò)濾液。

1.4 金銀花葉總黃酮樣品制備

將金銀花葉黃酮提取液進(jìn)行減壓濃縮蒸干后，用蒸餾水懸浮，等體積石油醚洗滌3 次，乙酸乙酯萃取3 次，回收乙酸乙酯部分，進(jìn)行減壓濃縮干燥，再用少量無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL，4 ℃保存，備用。

1.5 總黃酮含量測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確配制0.20 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液，分別 取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 和3.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法[6]在510 nm 處測(cè)定不同濃度蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度A510。以蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A510為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取6 份蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL，按“1.5.1”項(xiàng)下測(cè)定方法，在波長(zhǎng)510 nm 處分別測(cè)定其吸光度A510，計(jì)算RSD值。

1.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別量取“1.4”項(xiàng)下回流提取法得到的金銀花葉供試品溶液1.0 mL，于室溫條件下放置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 后，按照“1.5.1”項(xiàng)下測(cè)定方法，在波長(zhǎng)510 nm 處分別測(cè)定其吸光度A510，計(jì)算RSD值。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別量取6 份“1.4”項(xiàng)下回流提取法得到的金銀花葉供試品溶液1.0 mL，按照“1.5.1”項(xiàng)下方法，在波長(zhǎng)510 nm 處分別測(cè)定其吸光度A510，計(jì)算RSD值。

1.5.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別量取6 份“1.4”項(xiàng)下回流提取法得到的金銀花葉供試品溶液0.5 mL，再加入對(duì)照品溶液0.5 mL，按照“1.5.1”項(xiàng)下方法，在波長(zhǎng)510 nm 處分別測(cè)定其吸光度A510，計(jì)算RSD值。

1.5.6 金銀花葉總黃酮含量測(cè)定

精密取金銀花葉供試品溶液各1.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，按照“1.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算供試樣品中總黃酮含量。

1.6 金銀花葉總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 供試品及對(duì)照品維生素C 溶液配制

將“1.4”項(xiàng)下制備的金銀花葉供試品溶液和對(duì)照品維生素C 溶液分別配制成質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/mL、12.0 μg/mL、14.0 μg/mL、18.0 μg/mL、22.0 μg/mL、26.0 μg/mL、30.0 μg/mL、34.0 μg/mL、40.0 μg/mL、45.0 μg/mL、50.0 μg/mL、60.0 μg/mL、80.0 μg/mL的系列溶液，備用。

1.6.2 ABTS 樣品溶液配制

配制7 mmol/L 的ABTS 溶液與等體積的2.457 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合，室溫避光反應(yīng)16 h，得到ABTS 儲(chǔ)備液，備用。

1.6.3 金銀花葉總黃酮對(duì)ABTS 自由基的清除能力測(cè)定

ABTS 自由基清除率測(cè)定參考鮑素華、李艷榮[7-8]的方法并部分修改，取ABTS 儲(chǔ)備液用10 mmol/L PBS 緩沖液稀釋，使其在波長(zhǎng)734 nm 下的吸光值為0.70±0.02。

分別取0.3 mL 不同質(zhì)量濃度的供試品溶液和4.0 mL ABTS 工作液，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定各樣品溶液吸光為A1；用PBS 緩沖液代替ABTS 工作液，測(cè)定其吸光度為A0；用乙醇代替供試品溶液測(cè)定吸光度A2。根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為對(duì)照品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.013 5x-0.001 7，r2=0.999 9，其 在10 ～60 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)

取蘆丁對(duì)照品溶液或供試品分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)，其RSD值分別為1.09%、1.01%、0.40%（n=6），表明該試驗(yàn)精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均良好。

2.3 加樣回收率試驗(yàn)

對(duì)供試品溶液進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算其平均加樣回收率為97.91%，RSD值為1.24%，表明該試驗(yàn)加樣回收率結(jié)果良好。

2.4 金銀花葉總黃酮含量測(cè)定

3 種提取方法得到的供試品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表1。由表1 可知，回流提取、索氏提取和超聲輔助浸提法所得總黃酮含量分別為（4.87±0.02）mg/g、（3.83±0.03）mg/g、（2.85±0.02）mg/g（n=6），其中回流提取法所得的供試品中總黃酮含量最高。

表1 不同提取方法金銀花葉總黃酮測(cè)定結(jié)果 單位：mg/g

2.5 金銀花葉總黃酮對(duì)ABTS 自由基的清除能力測(cè)定

不同質(zhì)量濃度的金銀花葉總黃酮和對(duì)照品維生素C 對(duì)ABTS 自由基的清除率結(jié)果見圖1。如圖1 所示，在0 ～45.0 μg/mL 范圍內(nèi)，金銀花葉總黃酮對(duì)ABTS 自由基的清除率隨黃酮濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)總黃酮濃度為45.0 μg/mL 時(shí)，其清除率為92.21%，總黃酮濃度繼續(xù)增加，清除率趨于平衡。金銀花葉總黃酮和對(duì)照品維生素C 的IC50分別為17.015 μg/mL、25.072 μg/mL，表明金銀花葉總黃酮清除ABTS 自由基的能力強(qiáng)于維生素C。

圖1 金銀花葉總黃酮和維生素C 對(duì)ABTS 自由基的清除能力

3 結(jié)論

對(duì)蘆丁對(duì)照品或供試品溶液進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果表明其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收試驗(yàn)結(jié)果均良好。回流提取、索氏提取和超聲輔助浸提法3 種提取方法所得供試品總黃酮含量分別為（4.87±0.02）mg/g、（3.83±0.03）mg/g、（2.85±0.02）mg/g，其中乙醇回流提取法對(duì)金銀花葉總黃酮的提取效率最高。在0 ～45.0 μg/mL 范圍內(nèi)，金銀花葉總黃酮和維生素C 對(duì)ABTS 自由基的清除率隨濃度的升高而增強(qiáng)，且金銀花葉總黃酮清除ABTS 自由基的能力優(yōu)于維生素C。