王萌，劉智影，張碧玉，江寧，黃河，周如悅，周濤，黃慶利*

（1.徐州醫(yī)科大學(xué) 公共實(shí)驗(yàn)研究中心，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221004；3.徐州醫(yī)科大學(xué) 臨床學(xué)院，江蘇徐州 221004）

手術(shù)切除、化學(xué)藥物治療及放射治療是目前臨床治療癌癥的經(jīng)典方法[1]，其中化學(xué)藥物治療在術(shù)前和術(shù)后都廣泛應(yīng)用?；熓墙?jīng)口服、靜脈或者體腔給藥，通過血液循環(huán)起到抗腫瘤作用，但化療藥物不具有特定的抗腫瘤作用，對正常細(xì)胞也具有傷害性，因此化療后的病人常伴有各種副作用病癥[2]。減輕化療藥物的毒副作用，已成為科研人員的研究熱點(diǎn)。納米粒療法是一種新興的抗癌手段，由治療藥物（如小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)以及核酸等）和與之能組裝成納米粒子的類脂或高分子聚合物組成[3]。

碳納米材料因其相對低的生物毒性被廣泛應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)和腫瘤治療系統(tǒng)[4]，其中石墨烯材料由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和豐富的理化性質(zhì)備受研究者關(guān)注[5-6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，未經(jīng)任何修飾的石墨烯對巨噬細(xì)胞有明顯的毒性，但是當(dāng)其使用雙端羧基聚乙二醇（-HOOC-PEG-COOH-）修飾后，石墨烯的毒性有了大幅度的降低[7]。所以對于石墨烯進(jìn)行表面修飾增加其生物相容性是非常必要的。偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES/APS）[8]解決了石墨烯與其他物質(zhì)相連的問題，APS 易水解，放出乙醇，生成相應(yīng)的硅醇縮合物，由于具有堿性，通用性極強(qiáng)，分子中的C-NH2鍵內(nèi)氨基可與酸、羧酸酯、醛、酮、鹵代烴、酰胺和腈等多種物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。

同時(shí)，對于大多數(shù)腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)和治療系統(tǒng)，藥物不能很好地傳輸?shù)教囟ǖ哪[瘤位置，一直是制約其療效的一個(gè)重要原因。經(jīng)納米粒包裹后，藥物的生物相容性和對腫瘤細(xì)胞的靶向性均可得到改善，藥代動(dòng)力學(xué)以及藥效學(xué)特性得到改善和增強(qiáng)[9]。近年來，靶向治療越來越受到人們關(guān)注，合適的分子修飾以便能夠很好地識別腫瘤細(xì)胞是解決藥物靶向的關(guān)鍵，例如葉酸介導(dǎo)的抗腫瘤藥物可以靶向性地作用于葉酸受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，從而減少傳統(tǒng)化療藥物的副作用，提高藥效[10]。

本研究旨在以氧化石墨烯為載體，通過分子修飾改善其生物相容性和靶向性，以獲得性能優(yōu)良的新型腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)和治療系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC）、 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、葉酸（FA）、過硫酸銨（APS）、聚乙二醇（ PEG）和氯金酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石墨烯分散液（2 mg/mL），南京先豐納米科技有限公司；1640 培養(yǎng)基，江蘇凱基生物技術(shù)股份公司；胎牛血清，CLARK Bioscience公司；CCK-8 試劑盒，微科曼得生物工程有限公司。

Synergy2 型多功能微孔板檢測儀，美國BioTek公司；RCT 20L 基本型磁力恒溫?cái)嚢杵鳎聡鳬KA公司；UV1902 紫外可見分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；HFsafe-1500 型生物安全柜，香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；HF100 型二氧化碳培養(yǎng)箱，香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；FEI Tecnai 12 型透射電子顯微鏡，美國FEI 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GO@Au@PEG@FA@DOX 制備

將10 mg HAuCl4、10 mL GO（1 mg/mL）分散液和3 mL 酒精放入30 mL 水熱釜中混合均勻，100 ℃反應(yīng)6 h；反應(yīng)結(jié)束后取出，高速離心棄上清，加水洗滌3 次；將GO@Au 凍干，稱取重量，配制成1 mg/mL的溶液；取10 mL GO@Au、0.3 mL APS 和20 mg PEG，避光攪拌12 h；取出GO@Au@PEG 溶液，高速離心棄上清，加水洗滌3 次，烘干，稱取重量，配制成1 mg/mL的溶液；取8 mL GO@Au@PEG 溶液，加入4 mL 利用EDC 和NHS 活化后的葉酸，避光攪拌12 h；將GO@Au@PEG@FA 放入透析袋，用PBS 溶液透析6 h，透析3 次。

1.2.2 透射電子顯微鏡（TEM）測試

分別將樣本配制成低濃度溶液，滴在銅網(wǎng)上，自然晾干后，透射電子顯微鏡鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

分別復(fù)蘇卵巢癌細(xì)胞SKOV3 和人乳腺癌細(xì)胞MD231，待細(xì)胞長到80%左右時(shí)用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，入96 孔板，每孔100 μL，放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過夜，次日加藥處理或激光照射。

1.2.4 細(xì)胞光照

按照上述方法培養(yǎng)細(xì)胞鋪板并加藥處理，在細(xì)胞和藥物共培養(yǎng)3 h 后，從培養(yǎng)箱中取出96 孔板，每個(gè)孔用808 nm 的近紅外光照3 min。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測

CCK8培養(yǎng)基配制：取100 μL CCK8加入900 μL無血清培養(yǎng)基中。

藥物和光照處理后的細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，每孔中加入100 μL 稀釋好的CCK8 溶液，入培養(yǎng)箱中孵育30 min，后用酶標(biāo)儀檢測溶液吸光值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞生存曲線數(shù)據(jù)采用Student'sT檢驗(yàn)進(jìn)行評估，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Au 均勻分布在GO 表面

為了表征所得材料的形貌，利用透射電子顯微鏡對材料進(jìn)行觀察。透射電鏡結(jié)果表明，通過水熱反應(yīng)Au 納米粒子均勻負(fù)載到了GO 的片層結(jié)構(gòu)上，放大后可以看到Au 的直徑15 ～20 nm（圖1）；當(dāng)APS的量分別為0.1 mL、0.3 mL 和0.5 mL 時(shí)，Au 納米粒子負(fù)載到GO 片層的量并未發(fā)生較大改變（圖2）；為了進(jìn)一步驗(yàn)證Au 是否負(fù)載到GO 表面，利用紫外-可見光譜（UV-vis）對材料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GO-APSAu 在波長530 nm 處出現(xiàn)波峰（圖3），說明Au 成功負(fù)載到GO 表面；且當(dāng)APS 的量分別為0.1 mL、0.3 mL 和0.5 mL 時(shí),GO@APS@Au 在波長530 nm 處均出現(xiàn)波峰（圖4a），說明Au 是否負(fù)載到GO 表面與APS 相關(guān)性較?。蝗欢鳤u 是否負(fù)載到GO 表面與Au的量有關(guān)，UV-vis 圖譜顯示僅在HAuCl4為10 mg 時(shí)，GO-APS-Au 在波長530 nm 處出現(xiàn)波峰（圖4b），說明HAuCl4為10 mg 時(shí)Au 能夠負(fù)載到GO 表面。

圖1 0.3 mLAPS 和10 mgAu 電鏡圖像

圖2 不同APS 和Au 添加量的材料電鏡圖像

圖3 GO 和rGO@APS@Au 的紫外光譜

圖4 不同APS 和Au 添加量的材料紫外-可見光譜圖

2.2 GO@Au@PEG@FA 具有良好的光熱效應(yīng)

為了研究GO@Au 的光熱性能，分別測定了H2O、GO、GO@Au、GO@Au@PEG 和GO@Au@PEG@FA在功率為2 W/cm2、波長為808 nm 的近紅外光下的升溫曲線，如圖5 所示。從圖中看出GO@Au、GO@Au@PEG 和GO@Au@PEG@FA 在5 min 內(nèi)升高的溫度明顯高于H2O 和GO，并且加入PEG 和FA 后，對材料光熱效應(yīng)的影響并不大，說明所合成材料可以應(yīng)用于光熱治療。

圖5 不同材料的光熱轉(zhuǎn)換曲線圖

2.3 PEG 和FA 提高了材料與細(xì)胞的生物相容性

CCK8 結(jié) 果 示，PEG 與FA 修 飾 到APS 后，APS@PEG@FA 組對SKOV3 細(xì)胞存活率較APS 組有所恢復(fù)（圖6），說明PEG 和FA 提高了材料與細(xì)胞的生物相容性；利用不同濃度的APS@PEG@FA 分別處理卵巢癌細(xì)胞SKOV3（圖7a）和人乳腺癌細(xì)胞MD231（圖7b），發(fā)現(xiàn)APS@PEG@FA 具有一定的細(xì)胞毒性，但在10 μg/mL 濃度的時(shí)候，細(xì)胞生存率達(dá)到80%（圖7）。

圖6 CCK8 檢測不同納米材料對SKOV3 細(xì)胞生存率的影響圖

圖7 CCK8 檢測不同濃度的納米材料對SKOV3 細(xì)胞（a）和MD231細(xì)胞（b）生存率的影響圖

2.4 GO@Au@PEG@FA 具有較好的化療及光熱療效

利用所得納米材料GO@Au@PEG@FA 分別對SKOV3 細(xì)胞和MD231 細(xì)胞進(jìn)行化療和光熱療聯(lián)合治療，CCK8 結(jié)果顯示：GO@Au@PEG@FA 與近紅外光光照的聯(lián)合治療組較對照組和單一化療組或光熱組，細(xì)胞存活率顯著降低（圖8），說明聯(lián)合治療效果要優(yōu)于單一化療效果。

圖8 用10 μg/mLGO@Au@PEG@FA 孵育后，在激光照射和無激光照射下CCK8 檢測對于（a）SKOV3 細(xì)胞和（b）MD231 細(xì)胞生存率圖

3 結(jié)論與討論

納米技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展催生了一系列納米光熱材料[11]，這些材料不僅具有良好的生物相容性，也具有一定的光熱效應(yīng)。光熱治療是指一些對光有強(qiáng)吸收的物質(zhì)在激光照射下，將光能轉(zhuǎn)化為熱能從而殺死癌細(xì)胞的治療方法[12]。光熱療的材料包括無機(jī)和有機(jī)兩類，其中有機(jī)材料合成步驟煩瑣，因此近年來以金基納米材料為代表的無機(jī)光熱療材料受到越來越多人的關(guān)注[13]。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了金顆粒復(fù)合石墨烯納米材料GO@Au@PEG@FA，經(jīng)PEG 和FA 修飾后，增加了生物相容性及靶向性，同時(shí)又兼?zhèn)涔鉄徂D(zhuǎn)化性能，是一種很有前途的靶向抗癌藥物載體。本實(shí)驗(yàn)只研究了該載藥體系對腫瘤細(xì)胞的治療作用，后續(xù)需對其載藥之后的治療效果進(jìn)行評價(jià)。