張雪，楊樹林，邢一凡，張盛帆，李文婧，王憲昊，曲星雯，楊帆

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東泰安 271016；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東泰安 271000）

狂躁抑郁雙向情感障礙是一種兼有抑郁和狂躁，且常混合、交替反復(fù)發(fā)作的疾病，有文獻報道，腸道菌群可能通過其代謝產(chǎn)物色氨酸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起調(diào)節(jié)作用，從而引起宿主精神行為改變,并導(dǎo)致抑郁發(fā)生或加重[1]。本研究通過造模建立抑郁模型小鼠，并通過宏基因組測序技術(shù)研究抑郁癥小鼠與正常對照小鼠腸道菌群的微生物生態(tài)學(xué)特征，尋找兩組小鼠腸道菌群的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇4 周齡SPF 級雌性小鼠20 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 試劑與儀器

苯甲酸雌二醇注射液（規(guī)格：2 mL；4 mg），岑氏，杭州動物藥品廠；BSA323S 電子天平，賽多利斯。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組

將實驗小鼠隨機分為實驗組與對照組，通過金屬耳標編號，對照組為1 ～10 號，實驗組為11 ～20 號。

1.3.2 操作

體重檢測：測定體重前，將電子秤清潔并固定好，輕輕抓取小鼠，不要沾有墊料，將小鼠放在稱重盤內(nèi)，待示數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)并記錄；試驗開始后，連續(xù)記錄9 天。

飲食量檢測：每日飼喂實驗組和對照組定量、足量鼠糧，第二天稱量剩余鼠糧質(zhì)量，并計算各組的每日食量；記錄飲食第2 天后注射雌激素，連續(xù)記錄9 天。

皮下注射：小鼠背部進針，進行皮下注射。每2天注射一次，每只小鼠每次注射0.05 mL 苯甲酸雌二醇，共注射6 次，為期12 天。

新物體識別測試：將小鼠放在潔凈的放有未知物體的飼養(yǎng)籠中，用錄像設(shè)備記錄10 分鐘內(nèi)小鼠與物體的接觸情況，并計數(shù)接觸的次數(shù)；通過統(tǒng)計接觸次數(shù)的差異，分析小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

糞便采集及送檢：在造模前后分別采集實驗組和對照組小鼠糞便，直接抓取小鼠，小鼠受刺激自然排便后，將糞便放入無菌EP 管中。將糞便保存在-80 ℃冰箱中，干冰保存送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進行16S rDNA 微生物分類測序與糞便菌群分析。

16S rDNA 微生物分類測序與分析：本步驟由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基本過程包括：樣品的預(yù)處理；提取DNA；第一輪PCR 擴增；第二輪PCR 擴增；DNA 純化回收；定量混合；上機測序；軟件分析。

1.3.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間小鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化采用t-test 分析；腸道菌群豐度多組間比較采用Welch's t-test 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

對照組與實驗組體重記錄數(shù)據(jù)見表1 和表2，由表1 和表2 數(shù)據(jù)可知對照組小鼠與實驗組小鼠體重在實驗過程中均呈增長趨勢。

表1 對照組小鼠體重 單位：g

表2 實驗組小鼠體重 單位：g

2.2 飲食

對照組與實驗組小鼠實驗過程中飲食量數(shù)據(jù)見表3，由表3 數(shù)據(jù)可得，實驗組和對照組飲食量均存在不同程度的波動，實驗組小鼠飲食量波動較大，平均值小于對照組。

表3 飼喂1 ～9 天對照組和實驗組小鼠飲食量 單位：g

2.3 學(xué)習(xí)記憶能力變化

新物體識別實驗數(shù)據(jù)采用t-test 進行分析，對照組實驗前后學(xué)習(xí)記憶能力無顯著性差異，P值分別為0.103 2（P＞0.05）；實驗組小鼠造模前后以及造模后對照組和實驗組小鼠新物體識別能力均有顯著差異，P值分別為0.004 9 和0.000 1（P＜0.05），說明造模成功（見表4 和表5）。

表4 試驗前后對照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

表5 造模前后實驗組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

2.4 菌群基因組測序

2.4.1 測序數(shù)據(jù)

通過對對照組（HC）和實驗組（HA）兩組共計4個樣本（HC2、HC5、HA12 和HA17）進行16S rDNA測序、數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到有效序列377 695 條，對照組和實驗組分別得到優(yōu)化序列197 398 條和180 297 條，對照組平均長度為421.15 bp，實驗組平均長度為420.65 bp（見表6）。

表6 各樣本有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.4.2 OUT 聚類分析

對97%相似水平下的操作單元分類（Operational Taxonomic Unit，OTU）進行生物信息統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖1 所示。實驗組和對照組共有566 個OTU，兩組共有的OTU 為434，約占OUT 總數(shù)的76.7%；實驗組獨有的OTU 為50，對照組獨有的OUT 為82；HA 組共有484個OTU，對照組共有516個OUT。由圖1可知，大多菌群為實驗組、對照組兩組共有，對照組OUT總數(shù)略多于實驗組，即對照組種群多樣性略大于實驗組。

圖1 樣本OUT 分布韋恩圖

2.4.3 Alpha 指數(shù)分析

在OTU 的基礎(chǔ)上，通過計算Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)分析單個樣品的多樣性。樣品的多樣性可分為物種豐度和物種均勻度，若前面三項指數(shù)越大，最后一項指數(shù)越小，則表明樣品中的多樣性越豐富。樣本HA12、HA17、HC2 和HC5 的Alpha 多樣性統(tǒng)計結(jié)果如表7 所示。

由 表7 可 知，Shannon、Chao 和Ace 指 數(shù) 中對照組的兩樣本數(shù)值均比實驗組組要高，最后一項Simpson 指標對照組數(shù)值比實驗組要低，說明對照組物種多樣性整體大于實驗組。

表7 Alpha 多樣性統(tǒng)計結(jié)果

2.4.4 稀釋曲線分析

稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計這些序列對應(yīng)樣Alpha 多樣性指數(shù)，以抽取的數(shù)據(jù)量為橫軸，以Alpha多樣性指數(shù)值為縱軸繪制曲線，根據(jù)曲線是否達到平緩或達到平臺期來判斷本次測序數(shù)據(jù)量是否足夠。

對照組和實驗組Alpha 指數(shù)對應(yīng)的稀釋曲線如圖2 和圖3 所示。由圖2 和圖3 可知，指數(shù)稀釋性曲線指向一致且趨向平坦，證明本次測序數(shù)據(jù)量足夠。

圖2 HC 組Alpha 指數(shù)稀釋曲線

圖3 HA 組Alpha 指數(shù)稀釋曲線

2.4.5 群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.4.5.1 物種相對豐度圖

采用Welch's t-test 分析方法，分析樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。將多個樣本的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對比，使用較直觀的柱狀圖顯示，并將在所有樣本中豐度占比均小于1%的物種歸為others，其余的作為優(yōu)勢物種進行分析。

對照組與實驗組基于門（Phylum）和屬（Genus）分類水平的結(jié)果如圖4 和圖5 所示。由圖4 可知，在門水平，HC、HA 兩組樣品的優(yōu)勢菌落可分為5 大類：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和放線菌門（Actinobacteria）。其中，厚壁菌門和擬桿菌門在兩組樣品中占絕大多數(shù)，且在HA 組中擬桿菌門含量大于HC 組，厚壁菌門含量少于HC 組。

圖4 門水平的分析柱狀圖

由圖5 可知，在屬水平，HC、HA 兩組樣品的優(yōu)勢菌落可分為22 個屬。對照組占比前5 位的菌屬分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、別普雷沃菌屬（Alloprevotella）、阿利斯蒂普斯屬（Alistipes）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和螺桿菌屬（Helicobacter）；實驗組占比前5 位的菌屬分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、巴內(nèi)西埃拉屬（Barnesiella）、土桿菌屬（Turicibacter）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）和類桿菌屬（Bacteroides）。

圖5 屬水平的分析柱狀圖

2.4.5.2 Welch's t-test 分析

STAMP 差異分析用于比較兩組樣本之間物種或功能的豐度，通過此分析可獲得顯著性差異物種或功能以及該物種或功能更趨向何種環(huán)境條件下的樣本。當比較對象為組時，采用Welch's t-test，結(jié)果如圖6所示。由圖6 可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae和g_Roseburia 兩個屬在對照組、實驗組兩組間有顯著性差異，P值分別為0.023 和0.004（P＜0.05）。

圖6 Welch's t-test 分析

3 討論

近年來，隨著當代社會競爭壓力逐年上升，抑郁癥的發(fā)病率也隨之上升[2]，因此抑郁癥的相關(guān)發(fā)病及其防治機制的研究已經(jīng)成為艱巨且緊迫的任務(wù)。抑郁病人大多數(shù)存在食欲下降和體重減輕的軀體癥狀，也會出現(xiàn)記憶力下降、興致低迷以及認知功能障礙等變化[3]，因此當小鼠被給予外源性雌激素時，可造成小鼠體內(nèi)高雌激素狀態(tài)，從而出現(xiàn)行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的異常變化[4]。本實驗通過注射苯甲酸雌二醇使小鼠體內(nèi)形成高雌激素的病理狀態(tài)，小鼠會在體重、體溫、飲食等生理狀態(tài)以及學(xué)習(xí)能力等行為學(xué)方面表現(xiàn)出組內(nèi)和組間的變化[5-6]。對造模成功的小鼠抑郁模型進行糞便取樣，通過宏基因組測序探究抑郁小鼠與對照組之間菌群生態(tài)學(xué)的異同。

實驗結(jié)果表明，當雌性小鼠長期處于高雌激素的病理狀態(tài)下，會出現(xiàn)體重增長變慢、食欲降低以及學(xué)習(xí)記憶能力減退等抑郁樣表現(xiàn)。根據(jù)OUT 聚類分析，大多菌群為HA、HC 兩組共有，但HC 組OUT 總數(shù)略多于HA 組，表明HC 組種群多樣性略大于HA 組；Alpha 指數(shù)分析結(jié)果也說明HC 組物種多樣性整體大于HA 組；對菌群物種豐度進行統(tǒng)計以及Welch's t-test 分析可知，g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia 兩個屬在HC、HA 兩組間有顯著差異（P＜0.05）。

當人體出現(xiàn)腹瀉時，腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）在糞便菌群測定中高于正常菌群，同時測定5-HT 含量也高于正常菌群[7]，因此可對二者的相關(guān)性進一步探究。目前已有研究針對“腦-腸-微生物”軸影響大腦神經(jīng)的機制進行研究，并發(fā)現(xiàn)將普通小鼠的糞便移植于無菌小鼠后，其中樞5-HT 代謝異?？刹糠帜孓D(zhuǎn)，這些腸道微生物所介導(dǎo)的神經(jīng)生化改變，與抑郁癥患者所伴有的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸）失調(diào)相契合，從分子層面提示腸道微生物紊亂可能與抑郁發(fā)生相關(guān)[8]。在潰瘍性結(jié)腸炎治療的相關(guān)研究中，丁酸生成細菌（Roseburia intestinalis，R.I）鞭毛蛋白起到了一定的抗炎作用[9]，說明抑郁癥相關(guān)菌屬在炎癥性腸病中也有著至關(guān)重要的作用，可為抑郁癥及其并發(fā)腸道疾病的藥物研發(fā)以及療效監(jiān)測提供相關(guān)思路。

4 結(jié)論

小鼠長期處于高雌激素的病理狀態(tài)下會導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，抑郁小鼠腸道菌群多樣性小于正常小鼠，其豐度在界、門、綱、目、科這些層面上表現(xiàn)出統(tǒng)一性，而在菌屬層面上（g_unclassified_Enterobacteriaceae 和g_Roseburia）差異性明顯。