林陽君，莊梅琳

（泉州醫(yī)學高等專科學校 藥學院，福建泉州 362011）

噬菌體在自然界中是數量龐大的一個生物群體，據文獻報道，自然界中噬菌體的總數可達1032個之多[1]。噬菌體是感染細菌的病毒，存在于細菌的各種生存環(huán)境中，它們能感染特定種類的細菌，并能在細菌細胞內迅速增殖，最終將細菌殺滅。法國微生物學家D'HERELLE F 在1917 年[2]發(fā)現噬菌體后，就將其作為一種天然的抗菌治療方法在全世界推廣，并大范圍應用于公共衛(wèi)生領域[3]在1919 年，噬菌體首次被許可用于人類疾病的治療[4]，但二戰(zhàn)后，抗生素的成功應用使噬菌體治療的發(fā)展陷入了停滯?？股卦诂F代醫(yī)學的廣泛應用，使人類的壽命顯著延長，細菌感染也得到了有效控制。但同時，抗生素的過度使用也給人類帶來了細菌耐藥性、毒副作用和畜產品殘留的問題，這些都大大削弱了抗生素的醫(yī)學價值。2020年5 月，世界衛(wèi)生組織公布了2020 版的全球抗菌藥物的耐藥性和使用監(jiān)測系統(tǒng)（GLASS）報告[5]，涵蓋了全球66 個國家上萬個監(jiān)測點的數據顯示，抗生素耐藥的國家數量不斷增加，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等在內的越來越多的細菌感染已產生抗藥性。

衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)正面臨來自抗生素耐藥性的重大威脅，尋求包括噬菌體在內的抗生素代替物，又成為了研究的熱點[6-7]。大量的關于噬菌體治療的隨機臨床試驗初步表明了噬菌體的安全性和效果[8-12]。據報道[3,13-15]，目前已有一些純化的噬菌體制劑被安全地用于人類的局部、口服、靜脈和體腔治療。美國食品藥物管理局（FDA）已批準食品加工工業(yè)使用噬菌體，作為食用肉類和家禽產品等食品的抗菌添加劑[16]。噬菌體和噬菌體亞成分也被噴灑到人類食品[17]和寵物食品[18]上，或用于控制包裝食品中的食源性細菌[19]。已有針對食源性致病菌單核李斯特菌的噬菌體商業(yè)制劑，可用在乳制品工業(yè)和水產養(yǎng)殖中，從而減少抗生素的使用[20]。這些事實表明，噬菌體作為處理細菌污染的生物控制劑，正逐漸被人們所接受。

在本研究中，以大腸桿菌為宿主菌，從生活污水中分離得到的一株烈性大腸桿菌噬菌體，研究其生物學特性，并對其殺菌抑菌能力進行初步分析，為探索該噬菌體作為大腸桿菌污染的生物控制劑的可行性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 水樣與宿主菌

污水水樣，采樣于泉州醫(yī)學高等?？茖W校生活區(qū)污水；大腸桿菌（Escherichia coli，CMCC 44102），購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

0.22 μm 無菌微孔濾膜，德國Merck Millipore公 司；Amicon Ultra-15 離 心 超 濾 裝 置（15 mL，100 kDa），德國Merck Millipore 公司；GI54DWS 高溫高壓滅菌鍋，美國Zealway 公司；320R 高速冷凍離心機，德國Hettich公司；超低溫冰箱，中國海爾公司，H7650 透射電子顯微鏡，日本Hitachi 公司等。LB 固體培養(yǎng)基、LB 肉湯、瓊脂粉等，均購自上海展云化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 污水水樣處理

將取得的污水水樣用定性濾紙進行二次抽濾，去除大部分雜質與顆粒物。得到樣品濾液約200 mL 收集于無菌三角瓶中，加入CaCl2至終濃度1 mmol/L，混勻后靜置5 h，以提高水樣中噬菌體的收率[21]。

1.2.2 噬菌體的富集

在水樣中，噬菌體的數量可能較少而不易發(fā)現。因此，在篩選水樣中是否存在噬菌體時，需要先進行噬菌體的富集培養(yǎng)操作。將“1.2.1”中得到的粗濾液與大腸桿菌的對數期培養(yǎng)液混合后，靜置15 min，恒溫搖床120 r/min、36 ℃培養(yǎng)過夜。次日將得到的培養(yǎng)液在4 ℃下4 500 r/min 離心20 min，取上層清液，用0.22 μm 的無菌微孔濾膜過濾。濾液再加入新鮮的大腸桿菌對數期培養(yǎng)液，并重復上述操作2 次，最終得到噬菌體的富集濾液。

1.2.3 雙層平板法

以雙層平板法[22]驗證噬菌體的富集液中是否存在噬菌體。將噬菌體富集濾液稀釋至適當的稀釋倍數，取0.1 mL 稀釋液與0.1 mL 的大腸桿菌對數期培養(yǎng)液混合后于36 ℃中保溫15 min。再加入融化好的7 mL 半固體LB 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，隨后迅速倒入提前備好的LB 固體平板上，輕輕晃動平板至半固體培養(yǎng)基均勻平鋪于固體平板上。每個稀釋度平行做3 個平板。待平板凝固后，36 ℃倒置過夜培養(yǎng)。若次日在雙層平板上觀察到噬菌斑，則說明水樣中存在大腸桿菌噬菌體。

1.2.4 噬菌體的分離純化

若在雙層平板中觀察到噬菌斑，則用接種針從其上挑取邊緣清晰、透明度高、斑體較大的噬菌斑，接入10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，再加入0.1 mL 大腸桿菌對數期培養(yǎng)液，靜置15 min 后，36 ℃、120 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。次日采用“1.2.3”中的雙層平板法繼續(xù)觀察噬菌斑狀態(tài)，重復上述步驟直至挑選出大小一致、斑體較大的噬菌斑，即為噬菌體的分離純化。

1.2.5 噬菌體的滴度測定

噬菌體的滴度，即其效價，表示每毫升樣品中所有的具有侵染性的噬菌體的個數，又稱噬菌斑形成單位數（Plaque Forming Unit，PFU）。將由“1.2.4”中得到的純化噬菌體原液（以下簡稱噬原液）稀釋至適當倍數，0.1 mL 的梯度稀釋液與0.1 mL 的大腸桿菌對數期培養(yǎng)液混合后，采用“1.2.3”中的雙層平板法，在次日通過計算平板上的噬菌斑的數量測定噬菌體效價，規(guī)定單個平板上噬菌斑的數量在30 ～300 為合理計數范圍。

在此研究中，滴度（PFU/mL）按照式（1）計算：

式（1）中，a、b、c 分別為同個稀釋梯度的3 個平行平板上的噬菌斑數量，n為噬菌體原液的稀釋倍數。

1.2.6 最佳感染復數

感染復數（Multiplicity of Infection，MOI），亦稱感染倍數，其是指在感染時，噬菌體個數與細菌細胞數量的比值，也就是平均每一個細菌感染的噬菌體數量。在培養(yǎng)噬菌體的過程中，采用不同的噬菌體與宿主菌的比例，即不同的感染復數，得到的噬菌體的產率大不相同。因此存在一個噬菌體的最佳使用量可以獲得最大的裂解效應，即為該噬菌體的最佳感染復數。制備噬菌體原液（1×109PFU/mL）并稀釋至適當倍數，與大腸桿菌對數期培養(yǎng)液（細菌細胞濃度約為1×108CFU/mL）按MOI=1 000、100、10、1、0.1、0.01 和0.001 混合。36 ℃、120 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。次日，收集培養(yǎng)液置于4 ℃下4 500 r/min 離心15 min后，0.22 μm 無菌濾膜過濾，雙層平板測定噬菌體滴度，獲得最高滴度的MOI 即為最佳MOI。

1.2.7 噬菌體原液的超濾濃縮

為了在現代電子顯微鏡的高放大倍數下觀察到噬菌體的病毒顆粒，噬菌體懸液的濃度應達到一定的高濃度（約1×1012PFU/mL）[23]。本研究中采用超濾離心裝置對噬原液進行超濾濃縮，從而獲得高濃度的噬菌體懸液用于電鏡形態(tài)觀察。向經過預清洗的超濾離心裝置加入10 mL 的噬菌體原液，置于4 ℃低溫冷凍離心機中，使濾膜面板朝上放置裝置，5 000 g離心15 min。離心后，立即用200 μL 槍頭置于濾膜面板中回收超濾濃縮液，小心左右搖擺著吸取樣本，以確保完全回收。噬菌體超濾液保存在1.5 mL 凍存管中，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.8 噬菌體電子顯微鏡下的形態(tài)觀察

參考文獻[24]，采用磷鎢酸負染色法。取20 μL噬菌體濃縮液（約1×1012PFU/mL）滴加于覆有聚醋酸甲基乙烯酯（Formvar）膜的銅網（300 目）上，自然沉淀15 min 左右，濾紙從邊緣吸取多余剩余液體，自然風干，用2%磷鎢酸染液（PTA，pH7.0），負染5 min 后吸去多余液體，自然干燥。在加速電壓為80 kV 的條件下于透射電子顯微鏡中觀察噬菌體形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.9 固體培養(yǎng)基上殺菌抑菌能力測試

參考藥敏試驗中的濾紙片法，在LB 平板上，采用傾注法接種大腸桿菌。在已接種且凝固的平板上放入浸泡過噬原液（約1×109PFU/mL）的無菌濾紙片，注意紙片間距。置于36 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，次日觀察結果。

1.2.10 液體培養(yǎng)基中殺菌抑菌效果評估

培養(yǎng)獲得新鮮噬原液（約1×109PFU/mL）按最佳MOI 與大腸桿菌對數期培養(yǎng)液混合為實驗組，并建立無噬菌體的陰性對照管。靜置15 min 后，36 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)12 h。每隔30 min，取4 mL 混合培養(yǎng)液，以滅菌的LB 液體培養(yǎng)基為對照，測其600 nm 處OD 值。平行重復3 次測得其平均值。

2 結果與分析

2.1 噬菌體分離純化結果及滴度效價

多次取樣并進行噬菌體富集操作后，雙層平板法驗證水樣中存在大腸桿菌噬菌體，經分離純化，得到一株大腸桿菌噬菌體，命名為EW3-f4。噬菌體EW3-f4 的噬菌斑如圖1 所示，斑體透明，邊緣清晰，大小為0.7 ～1.3 mm。其滴度為1.58×109PFU/mL。

圖1 噬菌體EW3-f4 在雙層平板上的噬菌斑

2.2 最佳感染復數

以MOI 為橫坐標，以噬菌體EW3-f4 相應滴度的對數值為縱坐標作圖，得到圖2 曲線。如圖2 中曲線所示，噬菌體的最佳MOI 值為0.1。

圖2 噬菌體EW3-f4 的最佳MOI

2.3 噬菌體形態(tài)觀察

經超濾濃縮的噬菌體原液的滴度達到了1×1012PFU/mL，用負染色法在透射電子顯微鏡下觀察到噬菌體EW3-f4 的形態(tài)如圖3 所示。噬菌體EW3-f4有一個中等長度的多面體頭部（105 nm×92 nm），其中隱約可見環(huán)狀的核酸，尾部是一個可收縮的結構，長度約為103 nm，未觀察到明顯的尾絲結構。根據國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的第九次報告[25]和文獻[26]，該噬菌體的結構與A2 形態(tài)類的噬菌體的描述相符合，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）。

圖3 噬菌體EW3-f4 在透射電子顯微鏡下的形態(tài)

2.4 固體培養(yǎng)基上抑菌能力測試

培養(yǎng)后未經稀釋的噬菌體EW3-f4 原液（1×109PFU/mL），在固體培養(yǎng)基上的抑菌效果如圖4 所示，可見明顯、清晰的抑菌圈，抑菌圈a、b、c、d 的直徑分別為11 mm、9 mm、9 mm、10 mm，平均抑菌圈直徑為9.75 mm。

圖4 大腸桿菌噬菌體EW3-f4 在固體培養(yǎng)基上的抑菌效果

2.5 液體培養(yǎng)基中抑菌效果評估

噬菌體EW3-f4 在液體培養(yǎng)基中對大腸桿菌的生長抑制情況如圖5 所示。在0 ～3 h 之內，含噬菌體的實驗組的OD 值與陰性對照組的OD 值數值和趨勢相近，而從第3 h 開始，實驗組的OD 值開始下降，在7 h 左右達到最低值，隨后開始逐漸上升，在12 h時接近但仍然低于對照組的OD 值。結合對實驗組培養(yǎng)液的觀察，可能是由于液體培養(yǎng)基中細菌細胞碎片的增加使溶液的OD 值增加。

圖5 大腸桿菌噬菌體EW3-f4 在液體培養(yǎng)基中的抑菌情況

3 討論與結論

與噬菌體相比，抗生素是一種只能選擇性破壞細菌某些生理過程（如蛋白質或細胞壁合成）的化學物質。噬菌體療法則直接針對致病菌，用特異性強的噬菌體作為治療抗菌劑，會大大減少對微生物群體的破壞。關鍵的是，無論宿主是否對多種抗生素具有耐藥性，噬菌體都可以感染并殺死它們。這是因為細菌的抗生素耐藥性和其對噬菌體敏感性在很大程度上是無關的[27]，即使是耐藥菌對噬菌體的也同樣敏感。事實上，2017 年臺灣的一項研究發(fā)現[28]，耐藥的鮑曼不動桿菌比對抗生素敏感的細菌更容易被噬菌體殺死。

本研究以在生活和實驗室中較為常見的大腸桿菌為宿主菌，從生活污水中分離純化得到一株針對大腸桿菌的噬菌體，命名為EW3-f4。從環(huán)境中采集的水樣中分離噬菌體時，可能會因為噬菌體的數量較少而不易發(fā)現。因此在噬菌體分離前期，參考文獻[21]方法往污水水樣中加入一定濃度的Ca2+，在一定程度上促進噬菌體的吸附和裂解，從而提高噬菌體的收率。經過3 次的富集培養(yǎng)，就可以通過雙層平板法，用肉眼觀察噬菌斑來驗證噬菌體的存在。在本研究中，大腸桿菌噬菌體EW3-f4 是一株烈性噬菌體，在雙層平板培養(yǎng)基上形成的噬菌斑體透明，邊緣清晰，直徑大小為0.7 ～1.3 mm，其過夜培養(yǎng)的滴度為1.58×109PFU/mL，最佳感染復數（MOI）為0.1，較為容易得到高滴度的培養(yǎng)液且有較高的感染效率。為了對噬菌體EW3-f4 進行形態(tài)觀察，通過超濾法濃縮噬菌體原液，進行透射電鏡觀察。在電鏡照片中可以看到，噬菌體EW3-f4 的形態(tài)屬于復合對稱，有多面體的頭部（105 nm×92 nm）和可收縮的尾部（103 nm），屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae family）的A2 形態(tài)類的噬菌體[25-26]。

獲得大腸桿菌噬菌體EW3-f4 的基本信息后，對其的殺菌抑菌作用進行了初步探索。噬菌體EW3-f4原液在固體培養(yǎng)基上可以獲得明顯清晰的抑菌圈，平均直徑為9.75 mm。在液體培養(yǎng)基中，以未加入噬菌體的大腸桿菌培養(yǎng)為對照，通過OD 值來觀察噬菌體EW3-f4 的抑菌效果，結果表明EW3-f4 從第3 h 開始出現明顯的抑菌效果，在7 h 左右，抑菌效果達到峰值，此處OD 值接近0 h 時的OD 值，肉眼觀察到此時培養(yǎng)液接近澄清的狀態(tài)，后期雖然OD 值又逐漸升高，但結合對培養(yǎng)液的觀察，可能是由于培養(yǎng)液中大量的細菌碎片所導致的OD 值增加。綜上所述，噬菌體EW3-f4 在抑菌作用方面的表現，值得針對其作為大腸桿菌污染的生物控制劑的潛在能力，進行進一步的應用性研究。

噬菌體的遺傳多樣性、豐富性和普遍性，讓噬菌體療法可以通過不同的方法進行。噬菌體制劑是禁抗、限抗、替抗、無抗的最有潛力的替補，與疫苗和微生態(tài)制劑一樣，是更具生態(tài)特點的“新藥物”，它打破了人們因抗生素顯著的化學特性而形成對“藥物”的思維定勢。因此，建立和擴大噬菌體收集，優(yōu)化快速篩選感染用噬菌體的方法，以及全面了解噬菌體制劑的治療和應用實踐將會非常重要。