周郁，謝晨，富瑩瑩，洪建權(quán)，鄭昌戈

（江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）

熒光光譜法具有靈敏度高、成本低、易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于研究核酸和生物分子的結(jié)構(gòu)[1]、極性[2]、粘度[3]、pH[4]等高度敏感局部微環(huán)境中。因此熒光核苷類似物已成為研究核酸結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和對(duì)其進(jìn)行識(shí)別的重要工具。

熒光核苷類似物通過將共軛基團(tuán)以最小化結(jié)構(gòu)擾動(dòng)摻入并融合到堿基中進(jìn)行修飾，已被用作生物物理和生物技術(shù)應(yīng)用的探針[5]。具有雙環(huán)堿基結(jié)構(gòu)的熒光胞嘧啶類似物（PyC）近年來因其抗病毒活性和探針特性而廣受關(guān)注，其保持了穩(wěn)定的沃森-克里克H 鍵合面[6]，并擴(kuò)展了PyC 核的π 共軛結(jié)構(gòu)[7]。通過呋喃[8]、噻吩[9]、嘧啶[10]或苯[11]部分的鄰位修飾的PyC 可以獲得所需的光物理性質(zhì)，即光譜的紅移。相比于天然核苷，這些合成的熒光核苷類似物通常表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光特性。在PyC 核的鄰位修飾的熒光核苷類似物苯、嘧啶和噻吩的量子產(chǎn)率均很高，分別為0.32、0.28 和0.43[12]。因此，對(duì)苯環(huán)的對(duì)位進(jìn)一步修飾[13]，引入的負(fù)電/正電取代基可以增強(qiáng)或減少共軛的貧電子/富電子聯(lián)芳基體系的極化[14-15]。

盡管依靠分子結(jié)構(gòu)很難預(yù)測光物理性質(zhì)，但改性PyC 的聯(lián)芳基體系中的推挽相互作用始終對(duì)紅移吸收，發(fā)射最大值和增加的量子產(chǎn)率起重要作用。為了開發(fā)各種不干擾的熒光核苷類似物，以5-碘尿嘧啶（1）為原料，經(jīng)親核取代反應(yīng)得到2’，3’，5’-三苯甲酰氧基-5-(4-甲氧基苯基)尿苷（2），再合成5-碘尿苷核糖（3），其與對(duì)甲氧基苯硼酸經(jīng)Suzuki 偶聯(lián)反應(yīng)后，得到熒光尿苷類似物4。其合成路線如圖1 所示。

圖1 熒光核苷類似物（4）的合成路線

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聯(lián)硼酸頻哪醇酯（98%）、5-碘尿嘧啶（98%）、1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖（98%），安耐吉化學(xué)；其他溶劑均為市售產(chǎn)品，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用水為去離子水。

Bruker AVANCE 400 MHz 核磁共振譜儀，瑞士布魯克拜厄斯賓公司；MALDI SYNAPT MS 型質(zhì)譜儀，瑞士布魯克拜厄斯賓公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CARY Eclipse 熒光分光光度計(jì)，美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.2 5-(4-甲氧基苯)尿苷類似物（4）的合成

按照文獻(xiàn)[16]中的方法合成對(duì)甲氧基苯硼酸，該化合物為白色絮狀晶體，產(chǎn)率66.36%；1H NMR（400 MHz，DMSO）δ 7.76（d，2H），6.88（d，2H），3.76（s, 3H）。

化合物（2）：白色固體，產(chǎn)率45.88 %；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.43（s, 1H），8.97（d, 2H），7.96（d, 2H），7.88（s, 1H），7.85（d, 2H），7.69（t,2H），7.63（t, 1H），7.58 ～7.49（m, 3H），7.43（t,2H），6.32（d, 1H），5.87（q, 1H），5.75（m, 1H），4.86（m, 1H），4.71（dd, 1H），4.46（dd, 1H)。

化合物（3）：白色固體，產(chǎn)率80.31%；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.67（s, 1H），8.48（s, 1H），5.72（d, 1H），5.40（d, 1H），5.30（t, 1H），5.05（d,1H），4.03（q, 1H），3.98（q, 1H），3.67-3.84（m,1H），3.56（dt, 1H），3.48（dt, 1H)。

化合物（4）：白色粉末，產(chǎn)率50.78%；1H NMR（400 MHz, DMSO）δ 11.68（s, 1H），8.48（s, 1H），7.27（d, 2H），6.93（d, 2H），5.73（s, 1H），5.40（s,1H），5.25（s, 1H），5.06（s, 1H），4.04（s, 1H），4.00（s,1H），3.88（s, 1H），3.75（s, 1H），3.79（s, 1H），3.58（s, 3H）；13C NMR（101 MHz, DMSO） δ 161.65,159.99, 150.87, 146.76, 129.58, 120.35, 114.32, 89.36,85.87, 74.17, 70.23, 60.95, 55.38。

2 結(jié)果與分析

2.1 極性對(duì)光譜性質(zhì)的影響

2.1.1 化合物4 在極性溶劑中的光譜數(shù)據(jù)

測試了化合物4 在不同極性溶劑中的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。紫外檢測濃度均為1×10-4mol/L，熒光檢測濃度均為5×10-6mol/L。由表1可知，化合物4的最大吸光度與溶劑極性無明顯關(guān)系。化合物4 的最大吸收波長依次為317 nm、325 nm、331 nm、333 nm、335 nm 和336 nm，最大吸收波長隨極性增大發(fā)生藍(lán)移。化合物4 的發(fā)射峰分別位于425 nm、420 nm、416 nm、414 nm、412 nm 和411 nm，隨著溶劑極性的增大，化合物4 的發(fā)射峰發(fā)生了紅移。這是由于甲氧基苯上的氧原子增強(qiáng)了化合物的溶劑化效應(yīng)，使得化合物與溶劑之間的相互作用更強(qiáng)，因而其激發(fā)態(tài)更容易被微環(huán)境所穩(wěn)定，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)與基態(tài)之間的能極差減小，因此發(fā)射峰紅移。

表1 化合物4 在不同極性溶劑中的紫外吸收與熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)

2.1.2 斯托克斯位移與ET(30)之間的線性關(guān)系

斯托克斯位移與ET(30)之間的線性關(guān)系能體現(xiàn)生物分子對(duì)環(huán)境變化的敏感度，有助于研究微觀環(huán)境下生物分子的結(jié)構(gòu)以及性能的表達(dá)。根據(jù)斯托克斯位移的計(jì)算公式：1/λmax-1/λem，得到了化合物4 在相對(duì)應(yīng)溶劑極性的斯托克斯位移值。以溶劑ET(30)值為橫坐標(biāo)，斯托克斯位移為縱坐標(biāo)，作圖2?；衔? 的R2為0.995 23，即化合物4 的斯托克斯位移隨著溶劑極性增大而線性增大，說明斯托克斯位移與溶劑ET(30)值有非常高的線性相關(guān)性，化合物4 具備對(duì)溶劑極性敏感的特性。

圖2 溶劑ET(30)值與斯托克斯位移之間的線性關(guān)系

2.2 pH 值對(duì)光譜性質(zhì)的影響

2.2.1 紫外光譜數(shù)據(jù)

由表2 可知，隨著溶液pH 的逐漸增大，化合物4的最大吸收波長及吸光系數(shù)未發(fā)生規(guī)律變化，即化合物4 的吸收光譜不受溶液pH 的影響。

表2 化合物4 在不同pH 水溶液中的最大吸收波長及相應(yīng)的吸光系數(shù)

2.2.2 熒光光譜

如表3 所示，化合物4 的發(fā)射峰位移未隨pH 的變化而發(fā)生偏移，但其熒光強(qiáng)度卻隨pH 的逐漸增大而增強(qiáng)。

表3 4 在不同pH 水溶液中的發(fā)射峰及發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度

2.3 粘度對(duì)光譜性質(zhì)的影響

2.3.1 紫外光譜數(shù)據(jù)

由表4 可知，在不同粘度的甲醇溶液中，隨溶液粘度的增大，最大吸收波長和相對(duì)應(yīng)的吸光系數(shù)ε無明顯變化，說明化合物4 的紫外吸收光譜不會(huì)受到溶液粘度的影響。

表4 4 在不同粘度溶液中紫外光譜數(shù)據(jù)

2.3.2 熒光光譜

隨著溶液粘度的不斷增大，化合物4 的發(fā)射峰位移維持在420 nm，發(fā)射峰強(qiáng)度如圖3 所示，0 ～50 Pa·s 區(qū)間，隨粘度增大，化合物4 的發(fā)射峰強(qiáng)度具有20%左右的增長量；大于50 Pa·s 區(qū)間，熒光強(qiáng)度增大趨勢減緩，而后趨于穩(wěn)定。由此可知，溶液粘度的變化引起了化合物4 的熒光強(qiáng)度規(guī)律性的變化，故化合物4 對(duì)溶液粘度變化具有敏感性。

圖3 化合物4 的發(fā)射峰強(qiáng)度與溶液粘度的關(guān)系

2.4 熒光猝滅

熒光核苷類似物與天然核苷相互作用后產(chǎn)生的熒光猝滅，可衡量修飾后的堿基對(duì)核苷影響的大小，符合Stern-Volmer 方程（1）。

圖4 所示為化合物4 在不含猝滅劑時(shí)的熒光發(fā)射光譜。如圖5 所示，4 種天然核苷酸的濃度與化合物4 的熒光強(qiáng)度具有較好的線性關(guān)系，斜率依次為0.000 89（A）、0.002 07（G）、0.001 30（C）和0.004 35（T），猝滅常數(shù)Ksv 依次為0.000 89、0.002 07、0.001 30 和0.004 35，可知胸苷酸對(duì)化合物4 的熒光猝滅效果最好。

圖4 化合物4 在不含猝滅劑時(shí)的熒光發(fā)射光譜（c=5 μmol/L）

圖5 添加不同猝滅劑時(shí)化合物4 的熒光發(fā)射光譜（c=5 μmol/L）

天然核苷酸對(duì)化合物4 的熒光猝滅常數(shù)處于較低數(shù)值，說明化合物4對(duì)天然核苷酸的抗干擾性能好。即將化合物4 插入寡核苷酸，化合物4 的熒光強(qiáng)度依然能夠維持較高的水平，其光物理性質(zhì)也不會(huì)有太大的影響，能達(dá)到預(yù)期效果。

式中，F(xiàn)0為無猝滅劑時(shí)物質(zhì)的發(fā)射強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后物質(zhì)的發(fā)射強(qiáng)度；[NMPs]為猝滅劑的濃度；Ksv 為猝滅常數(shù)。

3 結(jié)論

化合物4 具備非常理想的光物理性質(zhì)，對(duì)溶劑極性、pH 值和粘度都具有一定的敏感性，其斯托克斯位移與相應(yīng)溶劑ET(30)的線性關(guān)系R2值達(dá)0.995 23；隨著pH 的增大，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；隨著粘度的逐漸增大，熒光強(qiáng)度發(fā)生規(guī)律性變化。4 種天然核苷酸對(duì)化合物4 的熒光強(qiáng)度均沒有較大的影響，猝滅常數(shù)數(shù)值較低，不影響對(duì)熒光類似物的檢測。故該類化合物可作為敏感性熒光探針，研究核酸微環(huán)境的極性、pH 值和粘度的變化。