李忠峰 王 磊 劉金文 張趁玲

（1.中牟縣廣惠街街道辦事處 河南中牟451450；2.中牟縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站 河南中牟451450；3.中牟縣原種場 河南中牟451450）

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬，為多年生草本園藝作物，具有適性廣、果期長、產(chǎn)量高、效益好等特點(diǎn)，是鄭州地區(qū)冬季時(shí)令水果。近年來，隨著都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，全國草莓種植面積已達(dá)11.997萬hm2，年產(chǎn)量306.03萬t，穩(wěn)居世界首位[1]。但是受連作障礙、不合理施肥和農(nóng)藥等諸多因素的影響，草莓紅斑葉枯病的發(fā)生日益頻繁，呈逐年加重發(fā)生趨勢(shì)，成為制約我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙。

草莓紅斑葉枯病是鄭州地區(qū)草莓生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)的一種新病害。該病最早于2017年9月在鄭州市中牟縣西春崗村由春峰草莓種植合作社理事長李峰首次發(fā)現(xiàn)，初發(fā)期他認(rèn)為是草莓缺素所致，采取補(bǔ)磷措施后仍不見好轉(zhuǎn)，且死棵現(xiàn)象十分嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)剌r(nóng)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。自2018年以來，該病連續(xù)2年在鄭州地區(qū)大面積發(fā)生，嚴(yán)重挫傷了草莓種植戶的種植積極性。經(jīng)過連續(xù)2年的田間觀察，草莓紅斑葉枯病以‘甜查理’品種受害最為嚴(yán)重，而紅顏、章姬、寧玉等品種則較輕。同時(shí)，該病常與草莓根腐病、炭疽病等混合發(fā)生，發(fā)生早、蔓延快、難控制，輕者死苗8.3%～13.7%，重者死苗率在50%以上，甚至整棚毀種，給廣大莓農(nóng)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前國內(nèi)外對(duì)草莓出現(xiàn)紅葉枯死的研究報(bào)道很多，且說法不一。多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為，草莓葉片發(fā)紅枯死是由草莓根腐病菌引起的[2-6]；張海英等[7]、林祥文等[8]、王 步云 等[9]、姚紅燕等[10]、任海英等[11]研究認(rèn)為，草莓炭疽病也能引起草莓葉片發(fā)紅枯死，其優(yōu)勢(shì)種為膠孢炭疽菌 （Colletotrechum gloeosporioides）、草莓炭疽菌 （Colletotrechum fragariae）、尖孢炭疽菌（Colletotrechum acutatum）等；還有一部分學(xué)者研究認(rèn)為，擬盤多毛孢也是草莓紅葉枯死的主要致病菌。如Chamorro等[12]首次報(bào)道了由Pestalotiopsis clavispora和Neopestalotiopsis clavispora侵染草莓，可造成草莓根冠變色及棕褐色壞死；寧志怨等[13]研究報(bào)道了安徽省草莓紅葉病是由棒狀擬盤多毛孢菌所引起，在國內(nèi)首次提出了草莓紅葉??；趙景楠[14]等研究認(rèn)為，棒狀擬盤多毛孢菌主要引起草莓棒孢葉斑病，發(fā)病初期草莓葉片上出現(xiàn)紅褐色的病斑，后擴(kuò)展為不規(guī)則形病斑，邊緣呈紅褐色，中央呈灰白色，并逐漸干枯死亡；徐淑華等[15]、張陽等[16]、趙宇等[17]則研究認(rèn)為，擬盤多毛孢（P.clavispora）引起河北滿城、北京昌平、山東青島等地區(qū)草莓出現(xiàn)紅葉枯死，是引起草莓根腐病的致病菌優(yōu)勢(shì)種。而河南對(duì)草莓紅葉、萎蔫枯死的病原鑒定研究尚處于空白。為明確河南草莓紅斑葉枯病的病菌種類，本研究采用室內(nèi)組織分離的方法，進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并通過抑菌圈比較試驗(yàn)和室內(nèi)毒力測(cè)定法對(duì)6種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選，以此指導(dǎo)鄭州地區(qū)草莓紅斑葉枯病的防治。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病株來源 草莓病葉標(biāo)本于2020年9月采自鄭州市中牟縣姚家鎮(zhèn)梁家村和刁家鄉(xiāng)小王莊村發(fā)病的草莓田。草莓品種為甜查理，病葉癥狀典型。

1.1.2 供試藥劑 1%申嗪霉素SC（上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司生產(chǎn)）、50%氯溴異氰尿酸WP（河南銀田精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)）、40%氟硅唑EC（美國杜邦有限責(zé)任公司生產(chǎn))、80%乙蒜素水劑AS（河南科邦化工有限公司生產(chǎn)）、25%吡唑醚菌酯EC（德國巴斯夫公司生產(chǎn)）、10%苯醚甲環(huán)唑WG（瑞士先正達(dá)公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法進(jìn)行分離，先用流水沖洗感染的葉片30 min，從病健交界處剪取5 mm大小的感病組織塊，置入培養(yǎng)皿中，用75%酒精浸泡30 s，再用1%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min，隨后用無菌水漂洗3次，吸干表面水分后接種于PDA平板上，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，挑取菌落轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)并純化，純化菌株編號(hào)保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將純化菌株在新鮮的PDA平板上活化4 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊移至PCA平板中央，置28℃黑暗培養(yǎng)，每日觀察病原菌的菌落形態(tài)、生長及顏色。培養(yǎng)15 d后，挑取少量菌絲制成水浸玻片，鏡檢病菌的分生孢子和孢子梗形態(tài)及產(chǎn)孢情況，并測(cè)量其大小。參考真菌分類學(xué)特征描述進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[18]。

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定 采用室內(nèi)離體葉片接種法進(jìn)行回接試驗(yàn)，通過對(duì)健康的草莓葉片進(jìn)行接種試驗(yàn)，檢驗(yàn)是否能發(fā)生草莓紅斑葉枯病。首先，將分離菌株轉(zhuǎn)入新鮮的PDA平板上培養(yǎng)，7 d后在菌落邊緣挑取直徑為5 mm的菌絲塊備用。其次，用純凈水對(duì)草莓葉片沖洗30 min，待葉片干燥后，用75%的酒精對(duì)葉面進(jìn)行消毒，然后用無菌水沖洗，并用無菌棉輕輕擦去殘留的水。接種時(shí)先用解剖針輕刺3～5次，將準(zhǔn)備好的菌絲塊貼于傷口處，然后用蘸過無菌水的棉球覆蓋、固定，用透明塑料袋包好保濕培養(yǎng)24 h后去掉保濕棉和菌絲塊。從第3天起連續(xù)觀察發(fā)病情況，待回接發(fā)病后，再進(jìn)行分離培養(yǎng)，鑒定病原菌種類，檢測(cè)病原菌致病性。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 病原菌ITS序列的測(cè)序委托河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院完成，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對(duì)[19-20]，用MEGA 5.2的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，共1 000次循環(huán)。

1.2.5 抑菌作用測(cè)定 采用生長速率法進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，根據(jù)各供試藥劑的田間推薦使用濃度，各設(shè)5個(gè)不同的濃度梯度，配制成不同濃度的帶藥PDA平板（表1），以每個(gè)濃度為1個(gè)處理，以不含藥的培養(yǎng)基為對(duì)照。在活化培養(yǎng)4 d的菌落邊緣用打孔器打取5 mm大小的菌絲塊，將其接種至不同濃度的帶藥PDA平板上。25℃培養(yǎng)7 d后，測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算相對(duì)抑制率及各殺菌劑的毒力回歸方程y=kx+b，并計(jì)算EC50值及相關(guān)系數(shù)。

表1 各供試藥劑濃度梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓紅斑葉枯病株田間癥狀觀察

田間受害病株癥狀表現(xiàn)：草莓幼苗定植后初期病癥不明顯，但植株長勢(shì)矮化、瘦弱，生長遲緩；初花期開始顯癥，葉片自下而上，在葉片外緣頂部1/3處呈紅褐色或灰褐色不規(guī)則斑點(diǎn)狀，僅葉脈保持綠色，后逐漸擴(kuò)展為橢圓形或不規(guī)則形病斑，邊緣呈紅褐色，中央灰白色，病斑周圍褪綠，有黃色暈圈，后期整個(gè)葉片呈紅褐色，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)葉片焦枯。拔出病株發(fā)現(xiàn)草莓根系多呈灰褐色或黑褐色，不發(fā)新根，或新發(fā)根系少，無根毛或須根，呈黃褐色，剖其根莖基部也未見髓部有異常的變色。該病傳染性極強(qiáng)，低溫、溫度大的條件下，病株附近的草莓苗也很快會(huì)表現(xiàn)出類似的癥狀。

2.2 對(duì)病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)病原菌分離和純化，從具有典型癥狀的病菌組織下獲得一株真菌CM3，該菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)5 d后，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色濃密狀菌絲體，表面呈波浪狀，背面淡黃色，8 d后菌落表面產(chǎn)生黑色點(diǎn)狀物，并分泌有黑色粘狀物。分生孢子呈紡錘形或梭形，有4個(gè)橫隔膜，測(cè)量大小為（19.35～32.50）μm×（8.1～9.2）μm。 分生孢子頂端細(xì)胞呈透明狀，并長有附屬絲，分生孢子中央深褐色。根據(jù)鏡檢病原菌的形態(tài)學(xué)特征，該病原菌與擬多盤鞭毛菌（Pestalotiopsis clarispora）相似。

2.3 對(duì)草莓的致病性測(cè)定

采用室內(nèi)離體葉片接種法，對(duì)健康的草莓嫩葉進(jìn)行回接試驗(yàn)，接種5 d后，在草莓葉片接種處出現(xiàn)褐色病斑，病斑周圍葉片褪綠，與之前在田間采集的病株葉片上的癥狀基本相似。接種7 d后，病斑腐爛部位產(chǎn)生白色菌絲，后期長出黑色小點(diǎn)。從接種后發(fā)病的葉片上可重新分離培養(yǎng)出該病菌，證明CM3是引起草莓紅斑葉枯病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院對(duì)病原菌CM3的基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增rDNA-ITS片段測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA 5.2的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（附圖），采用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)分析，CM3與GQ415344.1、KY962990.1、KY810807.1、KY810809.1、KY962989.1、KM264343.1、GU595048.1屬于同一分枝，同源性達(dá)100%，確定菌株CM3為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clarispora）。

附圖 MEGA 5.2對(duì)病原菌的ITS和185-rNDA序列的發(fā)育樹分析

2.5 室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

2.5.1 對(duì)病原菌菌絲生長的影響 由表2可知，6種藥劑對(duì)草莓紅斑葉枯病的菌絲生長均有一定程度的抑制作用，其生長速率隨著藥劑濃度的增加抑制率上升。其中，10%苯醚甲環(huán)唑WG抑制效果最好，抑制率達(dá)94.91%；1%申嗪霉素SC和50%氯溴異氰尿酸WP次之，抑制率分別為92.11%和91.05%；40%氟硅唑EC和25%吡唑醚菌酯EC抑制效果分別為89.12%、88.07%；對(duì)菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑AS，在最高濃度下其抑制率僅為84.91%。

表2 不同藥劑對(duì)病原菌菌絲生長的影響

2.5.2 對(duì)病原菌的毒力測(cè)定 由表3可知，在供試的6種藥劑中，10%苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡亩玖ψ顝?qiáng)，其EC50值最小，僅為11.88 mg/L；40%氟硅唑效果次之，其EC50值為33.29 mg/L；1%申嗪霉素和50%氯溴異氰尿酸EC50值分別為47.13 mg/L和68.21 mg/L，25%吡唑醚菌酯EC50值為91.34 mg/L；對(duì)菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑，其EC50值高達(dá)398.26 mg/L。

表3 不同藥劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前我國已經(jīng)成為草莓第一大生產(chǎn)國，隨著草莓種植面積的日益擴(kuò)大，連作年限的增長，草莓紅斑葉枯病的防治已成為草莓產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重大問題。本試驗(yàn)采用rDNA-ITS片段測(cè)序分析并結(jié)合致病性測(cè)定，將鄭州地區(qū)草莓紅斑葉枯病的病原菌鑒定為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clarispora）。該結(jié)論與寧志怨等[13]的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，在本試驗(yàn)中致病性測(cè)定時(shí)，棒狀擬盤多毛孢病原菌，既可以從解剖針輕刺的傷口侵染，也可直接侵染發(fā)病，這與趙景楠等[14]的研究發(fā)現(xiàn)從草莓上分離的P.clarispora致病性較弱，只可通過傷口侵染，但不能直接侵染的結(jié)論有所不同，這說明棒狀擬盤多毛孢致病性在不同地區(qū)存在明顯差異。

草莓紅斑葉枯病是設(shè)施草莓連作障礙生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的一種新病害。棒狀擬盤多毛孢菌在自然界中廣泛存在，種類繁多，可引起多種植物發(fā)病[21-25]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)對(duì)草莓病害的防治仍采取以藥劑防治為主、其他防治措施為輔的原則。本研究進(jìn)行了6種殺菌劑對(duì)草莓紅斑葉枯病的病原菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)病原菌的抑制率最高，達(dá)94.91%；其次為1%申嗪霉素SC和50%氯溴異氰尿酸WP，而80%乙蒜素水劑抑制率最差。毒力測(cè)定結(jié)果表明，10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)病原菌的毒力最強(qiáng)，其EC50值最小，僅為11.88 mg/L；其次依次為40%氟硅唑EC、1%申嗪霉素SC、50%氯溴異氰尿酸WP、25%吡唑醚菌酯EC，對(duì)菌絲生長抑制效果最差的是80%乙蒜素水劑AS，其EC50值高達(dá)398.26l mg/L。

由于棒狀擬盤多毛孢致病性較強(qiáng)，且草莓紅斑葉枯病在鄭州地區(qū)的發(fā)生、流行特點(diǎn)和發(fā)病規(guī)律尚缺乏深入了解，目前對(duì)其致病機(jī)理尚不清楚，一旦大面積發(fā)生將很難控制。同時(shí)，本研究的抑菌試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行的，今后有待于在大田生產(chǎn)中加以實(shí)踐應(yīng)用證實(shí)。