楊隆良，郭虎林，馬瑜

作者單位：1青海省第五人民醫(yī)院，a普外科，b腫瘤內(nèi)科，青海 西寧810000；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，青海 西寧810000

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是消化道第6大惡性腫瘤，其惡性程度高，病人預(yù)后差，5年生存期低于5%。研究其抑制靶點(diǎn)有助于延長病人生存期。

研究表明，與癌旁組織相比，在膽囊癌組織中有許多長鏈非編碼RNA（lncRNA）明顯上調(diào)或下調(diào)，在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。lncRNA Rpph1在多種癌癥中表達(dá)異常，參與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等。但是lncRNA Rpph1在膽囊癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究于2019年4—10月檢測(cè)膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中l(wèi)ncRNA Rpph1的表達(dá)，探討慢病毒介導(dǎo)沉默lncRNA Rpph1對(duì)膽囊癌細(xì)胞周期、增殖和凋亡的作用及潛在機(jī)制。以期為膽囊癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膽囊上皮細(xì)胞HGBEC及膽囊癌細(xì)胞系NOZ購自日本健康科學(xué)研究資源庫，SGC-996和GBC-SD購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）和細(xì)胞周期、凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，引物、lncRNA Rpph1慢病毒沉默載體（si-lnc Rpph1）和對(duì)照si-con購自上海吉瑪制藥有限公司；miR-384抗體、周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）抗體、Ki-67抗體、剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗體、剪切型胱天蛋白 酶9（Cleaved caspase-9）抗 體、β連 環(huán) 素（βcatenin）抗體、c-Myc抗體、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購自美國Santa cruz公司；慢病毒轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、real-time PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞HGBEC、膽囊癌SGC-996和NOZ細(xì)胞，在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)膽囊癌細(xì)胞GBCSD，培養(yǎng)液中均含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件：在濕度95%，37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，消化傳代。

1.2.2

慢病毒感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長期的GBC-SD細(xì)胞，將細(xì)胞以2×l0個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，按照慢病毒感染說明書進(jìn)行GBC-SD細(xì)胞感染，用陰性對(duì)照慢病毒si-con和攜帶si-lnc Rpph1的慢病毒感染GBC-SD細(xì)胞，分別為對(duì)照si-con組和si-lnc Rpph1組，感染24 h更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞狀態(tài)并檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Rpph1含量，對(duì)慢病毒干擾效果進(jìn)行驗(yàn)證，干擾成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)lncRNA Rpph1的表達(dá)用Trizol試劑提取HGBEC、GBC-SD、SGC-996和NOZ細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA）并檢測(cè)，然后以cDNA為模板，按照real-time PCR試劑盒的說明書進(jìn)行反應(yīng)，合成lncRNA Rpph1。lncRNA Rpph1正向引物5’-CAGACTGGGCAGGAGAAGCC-3’，反向引物5’-TCACCTCAGCCATTGAACTCG-3’。運(yùn)用2方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4

CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖將轉(zhuǎn)染后的GBC-SD培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸并稀釋細(xì)胞，以濃度2×10個(gè)/孔（200 μL細(xì)胞）接種于96孔板，NC組加入未轉(zhuǎn)染的GBC-SD細(xì)胞，在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)，加入20 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

1.2.5

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率將轉(zhuǎn)染后的GBC-SD培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞，用70%冷乙醇固定細(xì)胞4℃過夜，離心收集細(xì)胞，加入500 μL配制好的碘化丙啶染色液，避光37℃孵育30 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm波長處紅色熒光，計(jì)算各組G0～G1期、S期、G2～M期細(xì)胞百分比。根據(jù)凋亡試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法收集慢病毒轉(zhuǎn)染的GBC-SD細(xì)胞，裂解破碎細(xì)胞，收集蛋白，檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，CDK2抗體（1∶3 000）、Ki-67抗體（1∶2 000）、Cleaved caspase-3抗體（1∶1 000）、Cleaved caspase-9抗 體（1∶1 000）、βcatenin抗體（1∶2 000）、c-Myc抗體（1∶1 000）和抗βactin抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜。洗膜3次，然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA Rpph1在人肝囊上皮細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞系中的表達(dá)

HGBEC組、膽囊癌細(xì)胞系GBCSD、SGC-996和NOZ組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Rpph1含量分別為（1.07±0.13）、（4.89±0.31）、（3.42±0.42）、（3.96±

0.45

），

F

=195.965，

P

＜0.001。與HGBEC組相比，其余三組lncRNA Rpph1含量顯著升高（

P

＜0.05）；lncRNA Rpph1在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中表達(dá)情況一致（

P

＞0.05），采用GBC-SD進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默lncRNA Rpph1抑制膽囊癌GBC

-

SD細(xì)胞增殖

與si-con組相比，si-lnc Rpph1組的GBC-SD細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Rpph1表達(dá)量降低，細(xì)胞活性在24 h、48 h和72 h均顯著降低（

P

＜0.05），見表1。

表1 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1抑制膽囊癌GBC-SD細(xì)胞活性/±s

2.3 沉默lncRNA Rpph1誘導(dǎo)膽囊癌GBC

-

SD細(xì)胞周期阻滯

與si-con組相比，si-lnc Rpph1組的GBC-SD細(xì)胞中CDK2和Ki-67蛋白含量降低，G0～G1期細(xì)胞百分比顯著升高，S期細(xì)胞百分比顯著降低（

P

＜0.05），見圖1和表2。

圖1 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1表達(dá)對(duì)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞CDK2和Ki-67蛋白表達(dá)的影響

表2 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1對(duì)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞細(xì)胞周期及對(duì)CDK2、Ki-67蛋白表達(dá)的影響/±s

2.4 沉默lncRNA Rpph1促進(jìn)膽囊癌GBC

-

SD細(xì)胞凋亡

與si-con組相比，si-lnc Rpph1組的GBC-SD細(xì)胞中凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白含量均顯著升高，細(xì)胞凋亡率升高（

P

＜0.05），見圖2和表3。

表3 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1誘導(dǎo)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞凋亡/±s

圖2 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1對(duì)膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3表達(dá)的影響

2.5 沉默lncRNA Rpph1對(duì)膽囊癌GBC

-

SD細(xì)胞中Wnt/

β-

catenin信號(hào)通路的影響

與si-con組相比，si-lnc Rpph1組的GBC-SD細(xì)胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05），見圖3和表4。

表4 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1對(duì)膽囊癌GBCSD細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響/±s

圖3 沉默長鏈非編碼RNA（lncRNA）Rpph1膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究表明，多種lncRNAs在膽囊癌腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面均發(fā)揮重要作用。lncRNA Rpph1已被證實(shí)參與實(shí)體瘤、糖尿病腎病和神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展。結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA Rpph1顯著上調(diào)，lncRNA RPPH1在體內(nèi)外均可促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，并且lncRNA RPPH1過度表達(dá)與晚期TNM分期和不良預(yù)后相關(guān)。lncRNA Rpph1在乳腺癌細(xì)胞中也表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)可靶向miR-122促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞周期、增殖和克隆形成，且慢病毒介導(dǎo)的lncRNA RPPH1干擾抑制裸鼠的腫瘤生長。lncRNA Rpph1高表達(dá)預(yù)示急性髓系白血病病人總體生存率較低，慢病毒介導(dǎo)敲除lncRNA Rpph抑制了人急性髓系白血病細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，顯著抑制THP-1裸鼠移植瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，與HGBEC相比，lncRNA Rpph1在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中含量均顯著升高，與上述研究結(jié)果類似。本研究采用慢病毒感染膽囊癌GBC-SD細(xì)胞沉默lncRNA Rpph1以研究其對(duì)膽囊癌的作用，結(jié)果表明，沉默lncRNA Rpph1可抑制膽囊癌GBC-SD細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0～G1期，提高細(xì)胞凋亡率，降低CDK2和Ki-67蛋白含量，提高Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9含量。說明lncRNA Rpph1在膽囊癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，慢病毒介導(dǎo)的lncRNA RPPH1沉默可抑制膽囊癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具體分子機(jī)制尚不清楚。

Wnt/β-catenin作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，其在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞癌變、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。研究顯示膽囊癌樣本中Wnt/β-catenin異常激活，抗癌藥曲美替尼通過降低β-catenin的表達(dá)或抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)來阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而抑制膽囊癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。還有研究表明，lncRNA Rpph1在β-淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病體外細(xì)胞模型中過表達(dá)，lncRNA Rpph1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，通過直接靶向miR-122改善β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)沉默lncRNA Rpph1可使膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白βcatenin和c-Myc含量均降低，說明沉默lncRNA Rpph1可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，本研究闡述了lncRNA Rpph1在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996和NOZ中均上調(diào)。在膽囊癌GBC-SD細(xì)胞中，慢病毒介導(dǎo)沉默lncRNA Rpph1可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。lncRNA Rpph1可能是膽囊癌的潛在分子靶點(diǎn)。

本研究不足之處，只針對(duì)一種膽囊癌細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，還需對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)慢病毒介導(dǎo)沉默lncRNA Rpph1對(duì)膽囊癌的抑制作用。