陳浩舟，武愫斌

作者單位：商洛市中心醫(yī)院胸外科，陜西商洛726000

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，主要癥狀表現(xiàn)為咳嗽、痰中帶血或咯血、胸痛、氣急等，其病死率在惡性腫瘤中占據(jù)首位，對病人的生命健康安全造成嚴重威脅。目前臨床治療該疾病的方式有很多，其中全胸腔鏡肺葉切除術(shù)作為肺癌根治術(shù)應(yīng)用廣泛，但大多肺癌病人在確診時已屬晚期，癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，雖然手術(shù)治療可延長病人的生存時間，但病人術(shù)后5年生存率依然很低。肺癌的發(fā)生和發(fā)展是由多種基因共同調(diào)控的。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)分子，有調(diào)控細胞增殖和凋亡的作用。有研究報道，PI3K與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系。Notch-1是Notch家族的一員，其編碼的蛋白是一種高度保守的細胞表面受體，Notch信號的紊亂可直接或間接誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，已有研究發(fā)現(xiàn)Notch-1與乳腺癌、胃癌、宮頸癌等的發(fā)生有關(guān)。但至今關(guān)于PI3K、Notch-1兩者表達水平與肺癌病人預(yù)后的關(guān)系研究較少，因此本研究對肺癌病人組織中PI3K、Notch-1水平與預(yù)后的關(guān)系進行探討，旨在為臨床更準確預(yù)測肺癌病人的預(yù)后提供新的指標和充足的依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年5月至2014年5月于商洛市中心醫(yī)院行全胸腔鏡肺葉切除術(shù)治療的肺癌病人60例為研究對象，其中男40例，女20例；年齡（60.46±5.37）歲，范圍為38～75歲。以該60例肺癌病人的癌旁組織為對照。

1.2 選取標準

納入標準：①經(jīng)臨床病理學(xué)確診為非小細胞肺癌病人；②病人臨床病理資料完整；③行切除術(shù)前未進行任何放化療；④配合本次研究，并簽署知情同意書。排除標準：①有其他影響病人生存期的疾??；②病理資料缺失病人；③不配合本次研究者；④精神病病人。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 免疫組化法檢測肺癌病人組織中PI3K和Notch

-

1蛋白陽性表達

免疫組化法具體操作步驟如下：（1）對石蠟包埋的組織進行切片（厚度約為4.0 μm），每個組織切5片，于60℃下烘干2 h后采用二甲苯脫蠟，然后依次用不同濃度的乙醇溶液進行洗脫（順序依次為：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次；（2）加入過氧化氫酶阻斷溶液孵育10 min，PBS沖洗；（3）加入非免疫動物血清孵育1 h，向每張切片滴加50 μL一抗，于4℃下過夜孵育，PBS清洗；（4）加生物素標記的二抗，孵育10 min，PBS清洗；（5）滴加適量鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，孵育10 min，PBS清洗；（6）DAB顯色和蘇木素復(fù)染，用中性樹膠封固并于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。用已知陽性的病理切片作陽性對照，其中PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

實驗結(jié)果采用半定量法進行描述，即通過所取樣品的陽性染色強度和陽性細胞所占百分比來共同判定。每個實驗結(jié)果由3位專業(yè)人員獨立判斷評定，具體評分標準如下，PI3K陽性表達為細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，Notch-1陽性表達為細胞質(zhì)或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性強度評分：樣品無染色0分，樣品呈淺黃色1分，樣品為黃色2分，樣品為棕黃色3分。在顯微鏡下，每張切片隨機選擇3個高倍視野，按照陽性細胞所占百分比進行評分，標準為：陽性細胞率＜10%為0分；陽性細胞率在10%～50%之間為1分；陽性細胞率在＞50%～75%之間為2分；陽性細胞率＞75%為3分。根據(jù)染色指數(shù)（即染色強度與陽性細胞所占比例的評分乘積）大小將免疫組化結(jié)果進行等級劃分：0～3分為陰性，4～9分為陽性。其中陰性表示低表達，陽性表示高表達。

1.5 隨訪

對所有肺癌病人進行隨訪，隨訪截至2019年5月，死亡病人以死亡日期作為隨訪截止時間，觀察并統(tǒng)計肺癌病人5年生存時間。該研究隨訪率為100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0進行分析，以例（%）表示計數(shù)資料，行

χ

檢驗；采用Kaplan-Meier對病人5年生存時間繪制生存曲線，long-rank比較生存差異，logistic多元回歸判斷影響肺癌病人預(yù)后的獨立危險因素。

P

＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測PI3K和Notch

-

1蛋白表達情況

PI3K在癌組織中蛋白陽性表達率81.67%（49/60）顯著高于癌旁組織5.00%（3/60），Notch-1在癌組織中蛋白陽性表達率65.00%（39/60）也明顯高于癌旁組織8.33%（5/60）（

P

＜0.05）。

2.2 PI3K和Notch

-

1表達情況與病人臨床病理特征的關(guān)系

PI3K和Notch-1表達陽性與病人的性別、年齡、吸煙、飲酒及病理分型情況無關(guān)（

P＞

0.05）；而與病人的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（

P

＜0.05）。詳見表1。

表1 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和Notch-1表達情況與60例肺癌病人臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PI3K和Notch

-

1表達與病人預(yù)后的關(guān)系

PI3K蛋白陽性和陰性表達的5年生存率分別為8.0%、28.6%（

P

＜0.05）；且PI3K陽性病人中位生存時間為30.26個月，陰性病人中位生存時間為42.60個月（

P

＜0.05）；Notch-1蛋白陽性和陰性表達的5年生存率分別為16.0%、31.4%（

P

＜0.05）；Notch-1陰性病人中位生存時間為45.88個月，陽性病人中位生存時間為33.66個月（

P

＜0.05）。

2.4 影響肺癌病人預(yù)后危險因素的logistic多元回歸分析

以隨訪5年肺癌病人的生存結(jié)局為因變量（0=存活，1=死亡），TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PI3K及Notch-1表達水平為自變量，logistic回歸分析結(jié)果顯示：TNM分期、PI3K表達水平是影響肺癌病人預(yù)后的危險因素（

P

＜0.05）。見表2。

表2 影響肺癌病人預(yù)后危險因素的logistic多元回歸分析結(jié)果

3 討論

肺癌是一種起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，具有發(fā)病率、病死率增長快的特點。肺癌按組織學(xué)亞型主要被分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌較為常見，約占肺癌的85%。相關(guān)報道稱，近年來肺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。有研究顯示，全球每年新確診的肺癌人數(shù)高達160萬左右，且其病死率很高，預(yù)后極差，嚴重威脅病人的身體健康和生命安全，同時也給國家和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。因此，尋找能夠有效提高預(yù)測肺癌病人預(yù)后的分子指標具有很重要的臨床意義。

PI3K由ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ三部分組成，是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶。PI3K通路屬于細胞內(nèi)重要信號傳輸通道之一，廣泛參與細胞的生長、增殖及分化等，并在多種腫瘤中呈現(xiàn)異?；罨?。有研究顯示，PI3K在非小細胞肺癌中的異?；罨蚀蠹s為50%～70%，目前已成為臨床肺癌研究的焦點問題。而PI3K蛋白是PI3K通路的樞紐，其蛋白和基因的表達水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。姜霞等研究了RACK1、PI3K及Akt蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義，結(jié)果表明，PI3K蛋白表達在不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間有顯著差異，且其在肺癌組織中呈高表達，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。張大勇研究了PTEN基因、PI3K和Survivin基因在非小細胞肺癌病人腫瘤組織中的表達水平，并對其表達水平與非小細胞肺癌病人的臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性進行了探討，結(jié)果顯示，PI3K和Survivin在非小細胞肺癌病人癌組織中呈高表達，PTEN為低表達，且三者作為預(yù)后獨立預(yù)測的因素，對于臨床評估非小細胞肺癌病人預(yù)后效果具有重要價值。本研究中，PI3K在肺癌組織中蛋白表達陽性率明顯高于癌旁組織，呈高表達，其表達水平與臨床TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與病人的性別、年齡、吸煙、飲酒及病理分型情況無關(guān)；且Kaplan-Meier分析表明PI3K高表達者中位生存時間短于低表達者，多因素logistic分析顯示PI3K是影響肺癌病人預(yù)后的獨立危險因素。

Notch通路是一種重要的細胞間信號傳遞通道，其主要有Notch配體及Notch受體組成。Notch-1屬于Notch受體的一種，可結(jié)合Notch-1蛋白細胞膜表面配體來激活Notch通路，從而調(diào)控細胞的增殖、分化及凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常激活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wang等探討 了c-met和Notch-1共 表達與非小細胞肺癌預(yù)后不良的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，兩種受體同時表達的病人預(yù)后明顯低于未表達的病人，說明兩種受體的表達與非小細胞肺癌病人預(yù)后不良相關(guān)。肖維華等研究了Notch-1抗體在小細胞肺癌中表達的臨床意義，并對其預(yù)后的影響進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch-1抗體與小細胞肺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，Notch-1表達在小細胞肺癌的診斷及預(yù)后評估方面具有較好的應(yīng)用價值。本研究中，Notch-1在肺癌組織中呈高表達，且其表達水平與臨床TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Notch-1高表達者中位生存時間短于低表達者。

綜上所述，PI3K、Notch-1在肺癌病人組織中呈高表達，嚴重影響病人預(yù)后，且PI3K、TNM分期是肺癌病人預(yù)后獨立危險因素。本研究因納入樣本量較少，結(jié)果可能存在偏差，為提高研究的準確性，需要進一步擴大樣本量進行研究。