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        微小RNA-378調控小鼠急性肝衰竭作用機制的研究

        2021-09-02 08:58:40馮之文鮑勝華張文君陳曉鵬
        安徽醫(yī)藥 2021年9期
        關鍵詞:肝細胞試劑盒誘導

        馮之文,鮑勝華,張文君,陳曉鵬

        作者單位:皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院肝膽外科,安徽蕪湖241001

        急性肝衰竭常見誘因包括病毒性肝炎,藥物攝入過量,特異性藥物反應或藥物毒性。時至今日急性肝衰竭除了肝移植外尚無有效的治療方法,但因供體短缺限制了肝移植的進行。因此我們迫切地需要尋找治療急性肝衰竭的新方法。研究表明脂多糖誘導的急性肝衰竭大鼠的發(fā)病機制為刺激巨噬細胞釋放大量炎癥相關因子,進而誘導肝細胞壞死與凋亡。因此研究出抗凋亡的方法可能成為治療急性肝衰竭的新途徑。

        微小RNA(microRNAs)是一種長約21~25 nt的非編碼RNA,它在轉錄水平調控靶基因的表達并參與機體多種病理生理過程。大量研究表明改變特定microRNAs表達水平可調節(jié)急性肝衰竭的病理生理過程。Su等研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-674-5P(miR-674-5P)表達水平下調加重伴刀豆球蛋白(ConA)誘導的急性肝損傷狀態(tài);Yang等也發(fā)現(xiàn)微小RNA-125(miR-125)作為肝細胞凋亡重要調節(jié)因子,其表達量升高可減弱急性肝衰竭發(fā)展過程。但微小RNA-378(miR-378)在急性肝衰竭過程中的作用機制及是否和肝細胞凋亡過程存在聯(lián)系尚不清楚。研究表明miR-378可以控制肝臟纖維化和減弱脂肪肝的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)miR-378在很多疾病或腫瘤中伴有表達異常,如乳腺癌,而且其是肝細胞肝癌早期診斷與發(fā)現(xiàn)的血清標志物。本研究于2017年1月至2019年1月檢測小鼠急性肝衰竭模型中miR-378是否有表達異常,進一步探究miR-378在急性肝衰竭中作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        雄性巴比塞(BALB/c)小鼠36只,6~8周,體質量(20±2)g,所有實驗鼠由南京大學實驗動物中心提供,醫(yī)學實驗動物合格證號:No.11400700135473,醫(yī)學實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2012-0001。動物實驗是根據(jù)中國實驗室動物保護協(xié)會發(fā)布的實驗動物的護理和使用指南進行的。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

        1.2 主要試劑和儀器

        高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(美國Gibco公司),D氨基半乳糖(D-GalN)、脂多糖(美國Sigma-aldrich公司),0.22 μm及0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(上海吉瑪制藥技術有限公司),兔抗鼠胱天蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(rabbit-anti-Caspase-3 antibody)、兔抗鼠β肌動蛋白(β-actin)抗體(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗體及兔抗鼠二抗(碧云天生物技術有限公司),實驗所需試劑盒為RNA逆轉錄試劑盒、Taq PCR反應試劑盒(日本TaKaRa公司),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

        1.3 方法

        (1)急性肝衰竭動物模型的建立。將小鼠以隨機數(shù)字表法平均分成兩組,實驗組用D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合脂多糖10 μg/kg小鼠體質量的劑量腹腔注射誘導急性肝衰竭,對照組為腹腔注射等劑量的生理鹽水;每組分為6個時間點分別為誘導后0、1、3、5、7、9 h,每個時間點有3只實驗鼠。在相應時間點斷頸法處死小鼠后取靜脈血和肝組織。

        (2)血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定。摘除造模成功的小鼠眼球后取靜脈血,室溫放置2 h后經(jīng)2 000 r/min離心20 min,血清送至皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院檢驗科進行生化指標測定。

        (3)血清細胞因子TNF-α/IL-6水平測定。血液標本離心15 min(3 000 r/min)后取血清,使用ELISA檢測IL-6、TNF-α水平,具體方法參考試劑盒說明進行。每組實驗重復3遍。

        (4)逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。取肝臟組織,根據(jù)RNA提取試劑(Trizol)操作說明測定總RNA量。提取總RNA量后,用逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)進行RNA逆轉錄合成互補DNA(cDNA),使用適量的cDNA作為PCR模板,RT-PCR擴增儀進行PCR反應。我們以β-actin作為RT-PCR內參,以U6作為microRNAs內參,反應體系為20 μL,2方 法 分 析miR-378、TNF-α、IL-6及Caspase-3 mRNA的表達情況。

        (5)蛋白質印跡法(Western blotting)檢測Caspase-3表達量。組織蛋白溶于細胞裂解液中制備蛋白。用β-actin作為內參,使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉印將蛋白質轉印到PVDF膜上。轉膜完成后室溫密閉90 min,加入稀釋濃度為1∶1 000的抗Caspase-3單克隆抗體4℃過夜。次日洗一抗,每次10 min,洗3次。后室溫孵育二抗2 h,洗二抗,每次10 min,洗3次,曝光顯影,計算各條帶的灰度值,以β-actin為內參。

        2 結果

        2.1 急性肝衰竭模型中血清ALT/AST及細胞因子水平的變化

        血清中的ALT/AST是評估肝臟損傷的金標準,實驗組在藥物誘導后血清中的ALT/AST逐漸上升,而對照組生理鹽水誘導后ALT/AST水平未見明顯變化,見表1。相比對照組,實驗組TNF-α的mRNA水平在誘導后1 h(

        P

        <0.05)和7 h(

        P

        <0.05)明顯升高;同時血清中的TNF-α水平在誘導后1 h(

        P

        <0.05)和7 h(

        P

        <0.05)也明顯升高。而且IL-6在血清水平和mRNA水平與TNF-α有相似的趨勢。見表2。

        表1 兩組小鼠在藥物誘導后血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)變化/(U/mL,±s)

        表2 兩組小鼠在藥物誘導后1 h和7 h腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)mRNA和血清濃度表達變化/±s

        2.2 急性肝衰竭miR

        -

        378及Caspase

        -

        3表達量變化

        相較對照組,實驗組小鼠在給藥后5 h和7 hmiR-378表達量明顯降低(均

        P<

        0.05)。相反,實驗組小鼠給藥后5 h和7 hCaspase-3 mRNA表達量明顯升高(均

        P<

        0.05)。同時我們發(fā)現(xiàn)在實驗組中小鼠給藥后5 h和7 h Caspase-3蛋白水平的表達量也明顯升高(均

        P<

        0.05)。見表3,圖1。

        表3 兩組小鼠在藥物誘導后5 h和7 h miR-378和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)表達變化/±s

        圖1 蛋白質印跡法檢測兩組小鼠在藥物誘導后5 h和7 h Caspase-3蛋白表達結果

        3 討論

        急性肝衰竭臨床表現(xiàn)主要是凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病和腹水等,其進展迅速,死亡率極高。用D-GalN/脂多糖誘導小鼠急性肝衰竭模型的方法目前廣泛應用于研究人類急性肝衰竭機制的實驗中。我們用D-GalN/脂多糖聯(lián)合誘導建立小鼠急性肝衰竭模型。既往研究表明TNF-α和IL-6在急性肝損傷中可直接反應體內炎癥程度。我們研究中也發(fā)現(xiàn)急性肝衰竭模型中TNF-α和IL-6在mRNA和血清濃度均明顯升高,可見TNF-α和IL-6確實直接參與了急性肝損傷過程。同時我們在急性肝衰竭模型中發(fā)現(xiàn)血清ALT/AST水平逐漸升高,最終在誘導后7 h達到峰值,之后隨著誘導時間延長其水平降低,這和臨床病人特點相符合。以上血清學研究結果可為本實驗提供可靠的急性肝衰竭模型。

        微小RNA是近年來備受關注的一類分子,它是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA,研究發(fā)現(xiàn)它參與了生物體多種生理過程。大量研究表明改變特定microRNA表達水平可調節(jié)急性肝衰竭的病理生理過程。急性肝衰竭組織中檢測miR-378表達量明顯降低,因此我們推測miR-378可能參與急性肝衰竭發(fā)病過程的調控。D-GalN/脂多糖處理后誘導大量肝細胞損傷,且伴隨肝臟凋亡和壞死性改變。研究表明microRNAs可調控死亡受體、凋亡及凋亡前基因,然而在小鼠急性肝衰竭模型中microRNAs與細胞凋亡的相互作用機制尚未闡述。因此我們猜測microRNAs可調控肝細胞凋亡進而影響急性肝衰竭過程。

        腫瘤壞死因子是肝細胞凋亡的重要誘導因素,它與相應配體結合可觸發(fā)一系列的細胞內活動的發(fā)生,最終觸發(fā)caspase-3、8、9的活動從而引起凋亡的發(fā)生。實驗中我們發(fā)現(xiàn)血清學TNF-α水平明顯升高,這些結果表明凋亡通路在急性肝衰竭發(fā)展過程中具有重要意義。Caspase-3激活可引起PARP底物裂解活化進而使細胞凋亡發(fā)生。實驗證實在急性肝衰竭過程中,caspase-3蛋白水平在肝衰竭發(fā)生過程中增加。綜上表明:在急性肝衰竭發(fā)生過程中肝細胞凋亡增加。

        我們發(fā)現(xiàn)在小鼠肝衰竭模型miR-378表達量明顯降低而caspase-3表達明顯升高。TargetScan預測caspase-3是miR-378可能作用的靶點,據(jù)此我們推測在急性肝衰竭中miR-378低表達可增加caspase-3的表達,最終促進肝細胞凋亡。之前的研究也證實在小腸缺血再灌注損傷和大腦缺血損傷中miR-378可通過靶點caspase-3調控細胞凋亡。后續(xù)試驗我們需要進一步做細胞功能試驗以期驗證miR-378對肝細胞凋亡的調控作用??傊?,我們的研究證實了在急性肝衰竭過程中miR-378低表達可促進肝細胞凋亡,成果可以為急性肝衰竭的治療提供新的治療方法。

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