吳佳佳，吳戈，胡海圣，廖陳喜，梁翠瑩，孫寶清

作者單位：1廣州醫(yī)科大學南山學院，廣東廣州511436；2廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸健康研究院/呼吸疾病國家重點實驗室/國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心變態(tài)反應科，廣東廣州510120

變應性支氣管肺曲霉?。╝llergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）是一種以曲霉菌誘發(fā)的變態(tài)反應性炎癥為特點的復雜肺部疾病，主要見于支氣管哮喘或者囊性纖維化病人。在我國，ABPA多見于哮喘和支氣管擴張病人。根據不同的研究報道，ABPA在哮喘病人中的發(fā)病率約為2.5%～12.9%不等，而在真菌致敏的哮喘病人中，ABPA的發(fā)病率可達到40%。

目前，ABPA的具體發(fā)病機制還不完全明確，普遍認為是定植在肺部的煙曲霉誘導機體的Th2型免疫應答，從而產生白細胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13等細胞因子，導致免疫球蛋白E（IgE）異常升高以及嗜酸性粒細胞炎癥等。有研究認為，在過敏性哮喘病人中，若對煙曲霉致敏，隨著體內Th2型免疫應答的增加，最終可發(fā)展為ABPA。除了一些傳統(tǒng)的Th2型細胞因子，胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）是近年發(fā)現(xiàn)的一種與過敏性疾病關系密切的上皮來源的細胞因子，其能以特有方式激活樹突狀細胞，上調其表面OX40配體分子的表達，從而誘導Th0細胞向Th2細胞分化。此外，胸腺活化調節(jié)趨化因子（TARC/CCL17）也在多種過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，其主要作用為選擇性誘導T細胞的遷移，尤其是將Th2細胞從外周募集至炎癥部位。ABPA與過敏性哮喘病人雖然同樣存在常規(guī)的變態(tài)反應，但在臨床癥狀、疾病發(fā)病機制方面卻截然不同，所以對這兩種疾病免疫因子穩(wěn)態(tài)的研究可以為疾病的診治防研提供證據。然而，對于ABPA病人與普通的過敏性哮喘病人血清生物標志物差異的研究仍顯不足。為補充我國ABPA與過敏性哮喘病人免疫因子穩(wěn)態(tài)差異比較的空白，本研究分析了ABPA與過敏性哮喘病人血清中多種免疫因子的表達水平，并分析了這些因子對ABPA的診療價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年6月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院接收診治的ABPA病人23例和過敏性哮喘病人24例。入組標準為病人在臨床上被診斷為ABPA或過敏性哮喘，同時排除囊性纖維化的ABPA病人，排除合并肺癌或惡性腫瘤、急性/慢性肺部疾?。ㄈ缂毙苑窝住OPD等）、免疫缺陷或自身免疫疾病以及心臟病的病人。哮喘的診斷基于全球哮喘倡議（GINA）指南，其中包括病人的哮喘臨床特征以及氣流受限情況。在哮喘的病人中，結合相關病史資料，若臨床上特異性IgE檢測結果/或皮膚點刺試驗結果為陽性，則可被診斷為過敏性哮喘。ABPA是根據國際人類和動物真菌學學會（ISHAM）的診斷標準來診斷的，即哮喘或囊性纖維化病人滿足下列兩個必要條件：（1）煙曲霉抗原皮膚點刺試驗陽性或煙曲霉特異性IgE結果為陽性；（2）血清總IgE水平＞1 000 kUI/L（若其他條件均滿足，總IgE水平可＜1 000 kUI/L）；以及至少滿足兩個下列次要條件：（1）血清中存在針對煙曲霉的沉淀或免疫球蛋白G（IgG）抗體；（2）肺部影像學符合ABPA的特征；（3）血嗜酸性粒細胞計數＞500/μL（包括以往的結果）。本研究獲廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（GYFYY-2016-73），所有病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1

肺功能檢測與FeNO檢測肺功能檢測包括用力肺活量（FVC）、第一秒用力呼氣容積（FEV）預測值的百分比（FVC% pred，F(xiàn)EV% pred）以及一秒率。呼出氣一氧化氮（FeNO）的檢測（NioxMino，瑞典AerocrineAB公司）在肺功能檢測之前檢測。

1.2.2

血清IgE檢測用含有分離膠的真空采血管收集病人的靜脈血，并以3 000 r/min的轉速離心10 min獲得血清樣本。將血清樣本分裝并保存在-80℃的超低溫冰箱中，避免反復凍融。通過ImmunoCAP 1000系 統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）檢測血清中的總IgE以及特異性IgE的水平。

1.2.3

血清中TSLP、TARC和細胞因子的檢測病人血清中胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）和胸腺活化調節(jié)趨化因子（TARC）的濃度用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（R&D Systems Inc.，美國）進行檢測。血清中的細胞因子γ干擾素、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13和IL-17A用電化學發(fā)光法（MSD，MESO QuickPlex SQ 120，Model 1300，USA）進行檢測。

2 結果

2.1 ABPA與哮喘病人基線特征對比

如表1所示，兩組病人在年齡、性別與體質量指數（BMI）方面，均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。在肺功能方面，ABPA組的FEV% pred顯著低于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）；而FeNO則顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）。血常規(guī)方面，ABPA組中病人外周血嗜酸性粒細胞計數顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）。對于IgE的相關檢測結果，過敏性哮喘組中有9例病人（37.5%）的煙曲霉特異性IgE結果為陽性。此外，ABPA組總IgE水平顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.01）。而在用藥方面，兩組病人口服/吸入糖皮質激素的使用比例均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。

表1 研究人群基線特征對比

2.2 兩組血清TARC、TSLP及細胞因子的水平

兩組之間血清中TARC水平以及TSLP水平差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。對于所檢測的細胞因子，ABPA病人血清中IL-5水平以及IL-8水平均顯著高于過敏性哮喘病人（均

P

＜0.05）。此外，兩組間血清中其他細胞因子的比較（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A）差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 ABPA與過敏性哮喘病人間血清中細胞因子的比較/（ng/L，±s）

2.3 血清IL

-

5和IL

-

8在ABPA中的診斷效能

使用ROC曲線分析血清IL-5和IL-8水平在過敏性哮喘病人中診斷ABPA的效能。IL-5和IL-8診斷ABPA的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.902（

P

＜0.01）和0.720（

P

＜0.05）（圖1）。根據約登指數，IL-5的最佳截斷點為0.89 ng/L，在此截斷點的靈敏度和特異度分別為83.33%和90.91%；而IL-8的最佳截斷點為16.41 ng/L，在此截斷點的靈敏度和特異度分別為91.67%和54.55%。

圖1 血清白細胞介素（IL）-5和IL-8水平用于鑒別診斷變應性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）和哮喘的ROC曲線圖

3 討論

ABPA是一種慢性的肺部疾病，煙曲霉的長期暴露或定植會引起過敏性哮喘病人機體持續(xù)高水平的Th2型免疫反應，使血清IgE水平升高并同時出現(xiàn)嗜酸性粒細胞炎癥，導致支氣管擴張和持續(xù)性哮喘，并伴隨肺纖維化以及肺功能的喪失。支氣管哮喘是ABPA的易感條件之一。對過敏性哮喘與ABPA病人更多有效的生物標志物進行研究對認識疾病的發(fā)展機制具有重要作用。

研究表明，氣管上皮細胞分泌的多種細胞因子，如TSLP、骨膜蛋白等，均與Th2介導的哮喘相關，本課題組先前的研究也發(fā)現(xiàn)血清骨膜蛋白水平可作為鑒別診斷ABPA和煙曲霉致敏的過敏性哮喘的一個潛在的生物標志物。然而，本研究的結果顯示在ABPA和過敏性哮喘病人間，血清TSLP的水平差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。與之類似，雖然已有研究表明TARC可有效診斷囊性纖維化（CF）病人中的ABPA，但本研究的結果顯示TARC在過敏性哮喘病人和ABPA中差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞

0.05

）。在檢測的細胞因子中，本研究發(fā)現(xiàn)在ABPA和過敏性哮喘病人中血清IL-5和IL-8的表達差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。ABPA病人血清IL-5水平的升高標志著相比于過敏性哮喘病人，其嗜酸性粒細胞炎癥可能更為嚴重。而血清IL-8水平的升高可能與煙曲霉的定植、感染有關。此外，在其他細胞因子水平的比較中（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A），兩組病人差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。過敏性哮喘是一種慢性疾病，主要是由Th2主導的炎癥反應從而導致氣管的損傷以及重塑。在ABPA中，機體通過模式識別受體（PRR）途徑識別曲霉菌，導致Th2型細胞因子（IL-5和IL-13）增多以及γ干擾素降低。盡管有研究表明過敏性哮喘病人在病毒感染后會導致γ干擾素升高，但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)兩組病人血清中γ干擾素表達的差別（

P

＞0.05）。而對于血清中IL-13的表達，結果與本課題組先前的研究一致：雖然ABPA病人血清骨膜蛋白水平顯著高于哮喘病人，但IL-13作為骨膜蛋白的上游細胞因子卻在兩組間差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。在過敏性哮喘病人中，IL-10的基因以及蛋白表達降低，在ABPA病人中也會出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，IL-10表達的降低會導致嗜酸性粒細胞炎癥的增加。嚴重的哮喘病人血清中IL-17A的表達上調，而對于煙曲霉致敏的嚴重哮喘病人，他們最終可能發(fā)展為ABPA。在本研究中，兩組血清IL-17A差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。

本研究通過ROC曲線分析了血清IL-5和IL-8鑒別ABPA和過敏性哮喘的診斷效力，結果顯示兩者的曲線下面積（AUC）均＞0.7，而IL-5的AUC更是超過0.9。通過約登指數選擇的截斷點，在IL-5＞0.89 ng/L時，其靈敏度和特異度均在80%以上。外周血嗜酸性粒細胞計數是診斷ABPA的次要條件之一，同時也有研究報道了這項指標的截斷點。在ABPA的病理變化過程中，IL-5和IL-8可促進嗜酸性粒細胞浸潤以及激活，導致ABPA相比于過敏性哮喘病人會有更高水平的嗜酸性粒細胞炎癥，因此在臨床上檢測血清IL-5和IL-8水平，可以輔助鑒別診斷ABPA與過敏性哮喘。

綜上，與過敏性哮喘病人相比，ABPA血清IL-5和IL-8水平顯著升高，這可能與嗜酸性粒細胞增多以及煙曲霉的定植相關。此外，IL-5和IL-8可作為生物標志物輔助診斷過敏性哮喘中的ABPA病人。