葛海，何艮霞，朱迎春，李軍

作者單位：安徽省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內科，安徽 合肥230041

通信作者：李軍，男，副主任醫(yī)師，研究方向為神經(jīng)內科常見疾病內科治療，Email：439712162＠qq.com

急性腦梗死又稱為缺血性腦卒中，腦組織血氧供應不足，再加上缺血后再灌注等損傷，均會造成神經(jīng)元的凋亡。胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，是MAPKs家族主要成員之一，參與細胞編碼相關基因和細胞信號轉導，與神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2磷酸化在腦梗死后發(fā)揮神經(jīng)保護作用。山茱萸環(huán)烯醚萜苷（Cornus iridoid glycoside，CIG）是山茱萸科植物山茱萸的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用，可促進缺血大鼠的血管生成和神經(jīng)發(fā)生并減輕腦缺血大鼠的細胞凋亡和炎癥，改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸可能通過激活ERK途徑，作用機制可能是ERK1/2磷酸化水平增高，可以調節(jié)樹突蛋白合成，影響與神經(jīng)突觸可塑性相關的核轉錄因子和蛋白質翻譯起始因子的磷酸化狀態(tài)，提高老年性癡呆大鼠學習記憶能力；山茱萸多糖改善老年性癡呆大鼠學習記憶能力通過激活ERK途徑實現(xiàn)。另有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可抑制核因子-κB（NFκB）信號通路和ERK1/2信號通路激活，從而降低機體炎性水平，改善小鼠胰島素敏感水平和肝損傷程度。但是CIG對缺血再灌注小鼠神經(jīng)元細胞的影響及ERK1/2信號通路的調控報道較少。因此，本研究于2019年3—6月對此進行了初步研究，并探究其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實驗材料及試劑18只清潔級雄性ICR小鼠由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，周齡5～6周，體質量平均25 g，合格證號：SCXK（滬）20130024；CIG購自中國北京同仁堂（集團）有限責任公司；氯化三苯四氮唑（TTC）購自中國國藥集團上?；瘜W試劑公司；TUNEL檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；ERK1/2，B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2），Bcl-2相關X（Bax）蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）擴增序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成；實時熒光定量PCR試劑、cDNA Reverse Transcription kit、RNAiso plus（D9108A）Trizol均購自大連寶生物Takara公司；Bestar?Real time PCR Master Mix購自德國DBI公司；抗磷酸化胞外信號調節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）、Bcl-2、Bax抗體均購自Santa Cruz公司，ERK1/2、GAPDH抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰?；RIPA裂解液購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.1.2

實驗儀器RM2235石蠟切片機購自Leica公司；ABI7500fast熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司；PCR擴增儀購自美國Life technologies公司；紫外分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司；電泳儀、轉膜儀購自Bio-rad公司；酶標儀購自Thermo公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自GE公司；線栓購自廣州佳靈公司（線栓頭直徑0.18 mm）；CH-2 CX31熒光倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1

動物模型制備及分組參照文獻采用大腦中動脈栓塞法（MCAO）建立小鼠急性腦梗死模型。使用異氟烷麻醉小鼠后，暴露頸外動脈、頸總動脈、頸內動脈，頸外動脈近心端結扎，頸總動脈近心端結扎，于頸總動脈遠心端插入線栓，進線5 mm。根據(jù)隨機數(shù)字表法將18只清潔級雄性ICR小鼠分為對照組、模型組和實驗組，每組各6只。對照組小鼠不插入線栓，模型組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，實驗組小鼠腹腔注射150 mg/kgCIG，連續(xù)給藥7 d，每天給藥1次，7 d后再次對小鼠進行神經(jīng)損傷評分。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2.2

小鼠神經(jīng)功能缺損評分參照《現(xiàn)代藥理實驗方法學》進行小鼠的神經(jīng)功能缺損評分，評分≥5分表明造模成功，剔除模型組及實驗組造模評分＜5分的小鼠，評分越高代表小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.3

TTC染色法測定小鼠的腦梗死體積給藥7 d后對小鼠進行麻醉并處死，斷頭取出腦組織去掉嗅覺、小腦和低位腦干后，在海馬齒狀回平面連續(xù)冠狀切片，切成5組，每組約2 mm厚，置于2%的TTC溶液中避光染色，10%甲醛固定12 h，用圖像分析軟件計算梗死體積百分比，其中紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織。

1.2.4

TUNEL檢測測定腦梗死小鼠缺血側海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡上述腦組織冠狀切片脫蠟、水化后嚴格按照試劑盒說明書進行操作。染色后顯微鏡下觀察并記錄每個視野中細胞核被染成棕褐色和藍色的個數(shù)，每組記錄5個視野，計算平均凋亡率。其中細胞核被染為棕褐色的是凋亡細胞，細胞核被染為藍色的是正常細胞。計算凋亡率=100%×凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)）。

1.2.5

實時熒光定量PCR檢測急性腦梗死小鼠腦組織ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達量將小鼠梗死區(qū)腦組織消化離心后提取總RNA，測定總RNA濃度并將其濃度調節(jié)為1 mg/L，經(jīng)37℃，30 min，85℃，30 s反轉錄為互補DNA（cDNA）。cDNA用超純水稀釋后進行定量PCR，PCR擴增條件：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，31 s，40個循環(huán)，95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。以GAPDH作為參照，用2法計算mRNA的相對表達量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.6

蛋白質印跡法檢測急性腦梗死小鼠腦組織p-ERK1/2、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白的相對表達量將小鼠梗死區(qū)腦組織細胞裂解后，根據(jù)蛋白定量試劑盒提取總蛋白，測定總蛋白的濃度，取40 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢凝膠上的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜，用麗春紅染色后加入5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光試劑，曝光后采集圖像，計算各蛋白相對內參蛋白GAPDH的表達。

2 結果

2.1 CIG對急性腦梗死小鼠神經(jīng)功能的影響

給藥前，對照組、模型組、實驗組小鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為0分、（9.500±0.837）分、（9.667±0.516）分（

H=

12.793，

P

=0.002），模型組和實驗組評分顯著高于對照組（

P

＜0.05），但是模型組和實驗組差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），說明造模成功。給藥后，對照組、模型組、實驗組小鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為0分、（3.667±0.516）分、（2.333±0.516）分（

H=

15.395，

P

＜0.001），實驗組評分顯著低于模型組（

P

＜0.05），說明CIG能明顯緩解腦梗死小鼠的神經(jīng)功能損傷。

2.2 CIG對急性腦梗死小鼠腦梗死體積的影響

給藥7 d后，對照組、模型組、實驗組腦梗死小鼠腦梗死體積分別為0、（40.572±10.580）%、（22.795±

6.680

）%，實驗組小鼠腦梗死體積明顯小于模型組（

H=

13.008，

P

=0.001），說明CIG能明顯縮小腦梗死小鼠的腦梗死體積，見圖1。

2.3 CIG對急性腦梗死小鼠梗死區(qū)神經(jīng)元凋亡率的影響

對照組小鼠腦組織中神經(jīng)元細胞核基本未出現(xiàn)棕黃色，TUNEL檢測陽性細胞很少，神經(jīng)元的凋亡率為（1.983±1.071）%；模型組小鼠腦組織中出現(xiàn)較多深褐色、形態(tài)不規(guī)則、大小不一的固縮核細胞，神經(jīng)元凋亡率為（79.678±7.203）%；實驗組小鼠腦組織中出現(xiàn)深染、固縮核細胞的數(shù)量明顯較模型組少，神經(jīng)元凋亡率為（49.171±10.914）%，明顯高于對照組（

P

＜0.05），少于模型組（

P

＜0.05），說明CIG可明顯減少腦梗死小鼠腦組織的神經(jīng)元凋亡。見圖2。

2.4 CIG對急性腦梗死小鼠腦組織凋亡相關因子Bcl

-

2、Bax表達的影響

實時熒光定量PCR實驗及蛋白質印跡法結果均顯示，三組小鼠腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義（均

P

＜0.001），實驗組小鼠腦組織中Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達明顯較對照組下調（

P

＜0.05），較模型組上調（

P

＜0.05）；Bax mRNA及其蛋白的表達明顯較對照組上調（

P

＜0.05），較模型組下調（

P

＜0.05），說明CIG能明顯上調Bcl-2的表達，下調Bax的表達。見圖3、表2。

圖3 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對急性腦梗死小鼠腦組織凋亡相關因子B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X（Bax）蛋白表達的影響

表2 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對急性腦梗死小鼠B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X（Bax）mRNA和蛋白表達的影響/±s

2.5 CIG對急性腦梗死小鼠ERK1/2表達的影響

實時熒光定量PCR實驗結果顯示，對照組小鼠ERK1/2 mRNA表達量為（1.14±0.28），模型組小鼠ERK1/2 mRNA表達量為（1.21±0.12），實驗組小鼠ERK1/2 mRNA表達量為（1.16±0.14），三組小鼠腦組織中ERK1/2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（

F=

0.238，

P

=0.791）；蛋白質印跡法結果顯示，三組小鼠腦組織中ERK1/2蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義（

P

=0.633），實驗組p-ERK1/2蛋白的表達明顯較對照組和模型組上調（

P

＜0.05），模型組p-ERK1/2蛋白的表達明顯較對照組上調（

P

＜0.05），說明CIG可促進腦組織中ERK1/2的磷酸化，見圖4、表3。

表3 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對急性腦梗死小鼠ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響/±s

圖4 山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）對急性腦梗死小鼠p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達的影響

3 討論

腦梗死會造成缺血缺氧中心區(qū)的神經(jīng)細胞迅速壞死，處于缺血半暗帶的細胞易受到氧化應激、炎癥反應及興奮性毒性等刺激，若未得到及時有效的治療，神經(jīng)細胞會發(fā)生凋亡，并產(chǎn)生不可逆的腦損傷。因此，減少缺血半暗帶尚未病變的神經(jīng)細胞凋亡成為治療缺血性腦病的關鍵。CIG具有廣泛的生物活性，能夠抑制免疫作用、抗炎、抗血栓等。有研究發(fā)現(xiàn)，CIG的單體能降低大鼠腦缺血再灌注3d皮層梗死周邊區(qū)基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9的表達，從而保護血腦屏障功能。Qu等研究發(fā)現(xiàn)，CIG可通過抑制Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子信號（JAK/STAT）通路抑制神經(jīng)炎癥和小角質細胞活化，其可能是預防多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物。本研究結果顯示，實驗組小鼠的神經(jīng)功能損傷評分顯著低于模型組，腦梗死體積和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的凋亡率顯著低于模型組。提示CIG可明顯改善小鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及神經(jīng)元細胞的凋亡。

神經(jīng)元細胞的凋亡受多種因素調控，Bcl-2和Bax均是與細胞凋亡相關的基因，二者相互作用共同參與細胞的程序性凋亡過程。Bcl-2可與Bax蛋白形成多種二聚體，Bcl-2/Bcl-2、Bax/Bax、Bcl-2/Bax，而氧自由基及脂質過氧化物的生成、Ca超載均與二聚體比例有關。本研究結果顯示，實驗組小鼠腦組織中Bcl-2 mRNA及蛋白的表達明顯較模型組上調，Bax mRNA及蛋白的表達明顯較模型組下調。提示了CIG可上調急性腦梗死小鼠Bcl-2的表達，下調Bax的表達，抑制細胞凋亡。

ERK1/2介導信號通路是經(jīng)典的MAPK信號轉導途徑，與神經(jīng)元的生存和死亡密切相關。ERK1/2被磷酸化激活后會進入細胞核，參與某些基因的轉錄與表達，從而調節(jié)細胞的增殖與凋亡。Li的研究結果顯示，激活的ERK可降低N-甲基-D-天冬氨酸受體活性，抑制Ca內流，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死后p-ERK1/2表達增加，采用骨髓間充質干細胞（BMMNCs）干預后，p-ERK1/2的表達進一步上調，結果提示BMMNCs能夠促進ERK1/2的磷酸化水平，從而改善神經(jīng)功能，降低梗死范圍。本研究實時熒光定量PCR實驗及蛋白質印跡法均顯示，與對照組及模型組比較，實驗組小鼠腦組織中ERK1/2 mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，但是p-ERK1/2蛋白的水平明顯較對照組和模型組升高。提示了CIG能促進急性腦梗死小鼠腦組織中ERK1/2的磷酸化。因此本研究推測CIG通過促進ERK1/2的磷酸化，使得細胞核ERK1/2被磷酸化為p-ERK1/2，并進入細胞核，從而調節(jié)Bcl-2及Bax的轉錄與表達，減少神經(jīng)元細胞的凋亡。

綜上所述，CIG具有縮小腦梗死體積、減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用，通過抑制Bax的表達，促進Bcl-2的表達實現(xiàn)其神經(jīng)保護作用，可能通過調節(jié)ERK磷酸化實現(xiàn)調節(jié)抗凋亡及促凋亡蛋白之間的平衡，其具體機制還有待進一步的研究。

注：圖2中箭頭表示凋亡的神經(jīng)元細胞。