張翠翠，李強(qiáng)

作者單位：1棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 棗莊277100；2棗莊市立醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 棗莊277100

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其嚴(yán)重影響著人類的生活質(zhì)量，胃癌具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，尋找有效的藥物治療胃癌是目前醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)?；⒄溶帐菑幕⒄戎刑崛〕鰜淼能晤惢衔?，是白藜蘆醇同葡萄糖的結(jié)合產(chǎn)物，虎杖苷具有廣泛的藥理學(xué)作用，如平喘、鎮(zhèn)咳、降低膽固醇等。以前的研究表明，虎杖苷能夠抑制腫瘤生長，對(duì)于白血病、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生。虎杖苷抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，在研究虎杖苷誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其可以通過下調(diào)蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路的激活水平發(fā)揮抗腫瘤功效。目前對(duì)于虎杖苷在胃癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用和機(jī)制還不清楚。本次實(shí)驗(yàn)于2018年1月至2019年4月用虎杖苷處理體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，通過MTT法等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段探究虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、克隆、周期、凋亡的作用和機(jī)制，為虎杖苷治療胃癌的臨床應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞SGC-7901購自南京科佰生物科技有限公司；周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）抗體、Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白抗體購自美國Sigma-Aldrich；剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；虎杖苷購自北京索萊寶科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；磷酸化Akt（p-Akt）抗體購自美國Santa Cruz；Akt信號(hào)激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）購自美國Sigma。

1.2 MTT法測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞增殖活性

胃癌細(xì)胞接種到96孔板中，分成兩組，依次為對(duì)照組和虎杖苷組，虎杖苷組分成5個(gè)濃度梯度分別為2、4、6、8、10 μmol/L，對(duì)照組為0 μmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，分別在每個(gè)孔中添加10 μL的噻唑藍(lán)（MTT）溶液，繼續(xù)放在37℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后把孔內(nèi)的液體棄掉，添加150 μL的二甲基亞砜（DMSO）溶液，震蕩反應(yīng)10 min。以不含細(xì)胞的空白孔調(diào)零，檢測490 nm的吸光度。

1.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞克隆形成能力

胃癌細(xì)胞按照對(duì)照組和虎杖苷分組每個(gè)孔中添加250個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。添加磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞，然后以4%的多聚甲醛溶液固定20 min。將甲醛棄掉，添加10%結(jié)晶紫染色30 min。在室溫中晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。隨機(jī)選擇5個(gè)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值。

1.4 PI單染法測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞周期變化

收集培養(yǎng)處理48 h以后的對(duì)照組和虎杖苷組細(xì)胞，添加事先預(yù)冷后的PBS溶液，以1 000

g

離心10 min。把上清吸除，然后添加50 μL的PBS溶液，繼續(xù)加入70%的乙醇，放在4℃條件下反應(yīng)12 h。1 000

g

離心10 min，吸棄上清，添加PI染色液500 μL，在37℃條件下反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.5 Annexin V

-

FITC/PI雙染法測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞凋亡變化

收集培養(yǎng)處理48 h以后的對(duì)照組和虎杖苷組細(xì)胞，以PBS將細(xì)胞洗滌2次，以250 μL的結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/毫升。收集1 mL細(xì)胞至流式管中，然后添加PI和Annexin V-FITC溶液各5 μL到細(xì)胞中，放在避光條件下結(jié)合15 min。添加400 μL的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Cleaved

caspase

-

3、p

-

Akt蛋白水平

收集培養(yǎng)處理48 h以后的對(duì)照組和虎杖苷組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加RIPA裂解試劑，放在冰上裂解20 min。然后根據(jù)BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白的濃度。制備8%的分離膠以及5%的濃縮膠，按照每孔中加入40 μg的蛋白樣品上樣，預(yù)染蛋白Marker上樣量為5 μL。在濃縮膠中設(shè)置80 V電壓電泳，在分離膠中設(shè)置110 V電壓電泳。將凝膠取出，以100 V電壓轉(zhuǎn)膜，將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜裝置放在冰上操作。PVDF膜置于封閉液（5%牛血清白蛋白溶液）中，于室溫孵育2 h。然后將PVDF膜放在一抗中，在低溫4℃條件下孵育12 h。最后把PVDF膜放在1∶2 000稀釋以后的二抗反應(yīng)液中，在室溫中孵育2 h。將ECL超敏液滴加到PVDF膜上，以Bio-rad采集圖像，分析蛋白灰度值。內(nèi)參為GAPDH，分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 Akt信號(hào)激活劑IGF

-

1對(duì)虎杖苷調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、克隆、周期、凋亡的影響

以含有3 μg/L的Akt信號(hào)激活劑IGF-1和6 μmol/L的虎杖苷細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，設(shè)置為虎杖苷+IGF-1組，以虎杖苷組為對(duì)照，以上述MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)、PI單染、Annexin V-FITC/PI雙染以及蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞增殖、克隆、周期、凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Cleaved-caspase-3、p-Akt蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷抑制胃癌細(xì)胞增殖

對(duì)照組、2、4、6、8、10 μmol/L虎杖苷組吸光度分別為（0.58±0.06）、（0.45±0.03）、（0.38±0.03）、（0.31±0.02）、（0.25±0.02）、（0.20±0.01），

F

=166.429，

P

＜0.001。胃癌細(xì)胞經(jīng)過虎杖苷處理以后，細(xì)胞吸光度降低（

P

＜0.05）。6 μmol/L的虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞抑制率接近50%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用6 μmol/L的虎杖苷處理胃癌細(xì)胞。

2.2 虎杖苷抑制胃癌細(xì)胞克隆形成并阻滯細(xì)胞周期

結(jié)果見表1和圖1，胃癌細(xì)胞經(jīng)過虎杖苷處理以后，細(xì)胞克隆形成數(shù)目下降，G0/G1細(xì)胞比例升高，細(xì)胞中周期蛋白cyclin D1、CDK4表達(dá)水平下降?；⒄溶找种莆赴┘?xì)胞克隆形成并阻滯細(xì)胞周期。

表1 虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目、細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白水平變化/±s

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白水平

2.3 虎杖苷誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

結(jié)果見圖2、圖3、表2，胃癌細(xì)胞經(jīng)過虎杖苷處理以后，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高?；⒄溶照T導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞凋亡變化 圖5 流式細(xì)胞術(shù)測定虎杖苷和蛋白激酶B（Akt）信號(hào)激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）共同處理后胃癌細(xì)胞凋亡情況

表2 虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞凋亡率和Bcl-2相關(guān)X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）蛋白水平/±s

圖3 蛋白質(zhì)印跡法測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞中Bcl-2相關(guān)X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）蛋白水平

2.4 虎杖苷抑制胃癌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路激活

結(jié)果見圖4，胃癌細(xì)胞經(jīng)過虎杖苷處理以后，細(xì)胞中Akt信號(hào)通路蛋白p-Akt水平降低［（0.51±0.05）比（0.24±0.03），

t

=13.891，

P

＜0.001］。虎杖苷降低胃癌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路激活水平。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法測定虎杖苷處理后胃癌細(xì)胞中磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)

2.5 Akt信號(hào)激活劑IGF

-

1逆轉(zhuǎn)虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、克隆、周期、凋亡的影響

結(jié)果見圖5、圖6、表3，Akt信號(hào)激活劑IGF-1可以提高虎杖苷作用條件下胃癌細(xì)胞吸光度和克隆形成數(shù)目，減少G0/G1期細(xì)胞比例，減少細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞中cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)水平，減少細(xì)胞中Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞中p-Akt/Akt水平。Akt信號(hào)激活劑IGF-1逆轉(zhuǎn)虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、克隆、周期、凋亡的影響。

表3 虎杖苷和Akt信號(hào)激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）共同處理后胃癌細(xì)胞吸光度、克隆形成數(shù)目、周期分布、凋亡率和細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白水平/±s

圖6 蛋白質(zhì)印跡法測定虎杖苷和Akt信號(hào)激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）共同處理后胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）、剪切型胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化-Akt（p-Akt）蛋白水平

3 討論

虎杖苷是從虎杖中提取出來的一種單體，是一種羥基二苯乙烯類化合物，國內(nèi)外的研究顯示，虎杖苷可以加強(qiáng)心肌舒張及收縮功能、抑制血栓形成、改善微循環(huán)、降血脂，對(duì)于結(jié)腸炎、子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致的疼痛也具有改善作用。虎杖苷具有腫瘤預(yù)防和治療的作用，其對(duì)于小鼠移植性肝癌具有抑制作用，能夠明顯降低肺癌、宮頸癌等細(xì)胞生長速度。本次實(shí)驗(yàn)顯示，虎杖苷處理后的胃癌增殖、克隆能力均下降，提示虎杖苷可以抑制胃癌細(xì)胞增殖，虎杖苷具有抗胃癌進(jìn)展的作用。

本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)虎杖苷處理后的胃癌細(xì)胞G0/G1比例升高，細(xì)胞凋亡增加，說明虎杖苷可能通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤功效。細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，分裂間期是細(xì)胞增殖能力改變的關(guān)鍵。G0/G1期是DNA物質(zhì)準(zhǔn)備階段，受到細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的調(diào)控作用，cyclin D1是細(xì)胞周期素中與腫瘤關(guān)系最為密切的調(diào)節(jié)因子，其是CDK4的調(diào)控亞基，參與細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變過程，cyclin D1可以與CDK4結(jié)合刺激細(xì)胞生長，影響細(xì)胞周期進(jìn)展。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期一樣，受到細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)調(diào)控作用，Caspase蛋白家族是目前研究最多的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的直接調(diào)控因子，其含有多個(gè)蛋白成員，分別在細(xì)胞凋亡反應(yīng)中發(fā)揮不同的作用，Caspase-3是位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的執(zhí)行因子，正常情況下以沒有活性的酶原形式存在，只有被激活形成Cleaved-caspase-3后才可以不可逆的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，是一種促凋亡蛋白。我們的實(shí)驗(yàn)表明，虎杖苷處理后的胃癌細(xì)胞中cyclin D1、CDK4蛋白水平下降，Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平升高，提示虎杖苷阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，這與細(xì)胞周期和凋亡檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞的作用。

目前對(duì)于虎杖苷抗腫瘤機(jī)制的研究表明，其可以通過下調(diào)細(xì)胞中Akt信號(hào)通路的激活水平抑制宮頸癌細(xì)胞生長。Akt信號(hào)通路具有多種作用，在人體組織中廣泛存在，對(duì)于細(xì)胞生長、凋亡等具有明顯的調(diào)控功能。研究報(bào)道證實(shí)，腫瘤組織中存在Akt信號(hào)通路過度激活現(xiàn)象，而抑制Akt信號(hào)激活可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生長。p-Akt是Akt的磷酸化形式，其水平升高是Akt信號(hào)激活的標(biāo)志。本次實(shí)驗(yàn)顯示，虎杖苷處理后的胃癌細(xì)胞中p-Akt水平降低，并且Akt信號(hào)激活劑可以逆轉(zhuǎn)虎杖苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、克隆抑制和細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，證實(shí)虎杖苷抗胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為機(jī)制與Akt信號(hào)有關(guān)。

總之，虎杖苷能夠在體外抑制胃癌細(xì)胞的惡性生長、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，虎杖苷對(duì)于胃癌進(jìn)展具有抑制作用，其作用機(jī)制與下調(diào)Akt信號(hào)激活水平有關(guān)。我們的結(jié)果為研究虎杖苷抗腫瘤機(jī)制提供了參考，為虎杖苷治療胃癌的臨床應(yīng)用提供了理論資料。