龍凱，王娟，彭建彪（云南省紅河州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 蒙自 661199）

清開靈注射液主要由豬去氧膽酸、膽酸、梔子、黃芩苷、金銀花等8 味中藥制成，具有清熱化痰、醒神開竅的功效，多用于熱病、神昏、上呼吸道感染、肺炎證候者。豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸為其主要有效成分，《中國(guó)藥典》2020年版一部中收載了該品種豬去氧膽酸、膽酸、梔子、黃芩苷含量測(cè)定的HPLC 方法[1]，但需用兩種不同的檢測(cè)器分別進(jìn)行測(cè)定，主色譜峰出峰時(shí)間較長(zhǎng)，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未制訂金銀花含量測(cè)定的項(xiàng)目，沒有進(jìn)行全面質(zhì)量控制。目前尚無(wú)同時(shí)測(cè)定該劑型5 種成分含量的相關(guān)報(bào)道[2-4]，日常質(zhì)量檢測(cè)工作中操作繁瑣費(fèi)時(shí)，為簡(jiǎn)化檢測(cè)方法，研究采用LC-ESI-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定清開靈注射液中5 種成分的含量。

1 儀器及試藥

Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Scientific）；AB SCIEX QTRAP4500三重四極桿質(zhì)譜儀（AB SCIEX 公司）；Sartorius BP211D 電子天平（德國(guó)賽多利斯）。豬去氧膽酸（批號(hào)：100087-201411，含量：99.7%）、膽酸（批號(hào)：100078-201415，含量：98.9%）、梔子苷（批號(hào)：110749-201919，含量：97.1%）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201821，含量：95.4%）、綠原酸（批號(hào)：110753-202018，含量：96.1%），（對(duì)照品中國(guó)食品藥品檢定研究院）；清開靈注射液（吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10 mL/支，批號(hào)：20011803、20021901、20041505、20030601、20042801、20061102）；甲醇（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司）；水為超純水；其余試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE UltraCore 2.5 Super C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～3.0 min，5%A；3.0～4.0 min，5%～100%A；4.0～8.0 min，100%A；8.0～9.0 min，100%～5%A；9.0～10.0 min，5%A）；流速：0.4 mL·min－1；進(jìn)樣量：2 μL：柱溫：40℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；檢測(cè)方式：正負(fù)離子切換模式；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化電壓：正負(fù)離子模式均為4500 V；干燥氣（N2）溫度：500 ℃；噴霧氣（N2）壓力：50 psi；5 種成分質(zhì)譜參數(shù)[5-7]見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Mass spectrum parameters

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸對(duì)照品適量，置25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含豬去氧膽酸372 μg、膽酸361 μg、梔子苷94 μg、黃芩苷563 μg、綠原酸55 μg 的混合對(duì)照品溶液（均按純度折算）。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液（甲醇），按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，圖中可見空白溶液在豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾峰。

圖1 清開靈注射液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖Fig 1 MRM chromatogram of Qingkailing injection

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為系列混合對(duì)照品溶液，各精密吸取2 μL 進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限Tab 2 Linearity，limit of detection and limit of quantization

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下分析條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸峰面積RSD分別為0.99%、0.93%、0.83%、0.77%、1.0%（n＝6）。間隔24 h 取同一混合對(duì)照品溶液在相同分析條件下再連續(xù)進(jìn)樣6 次，5 種成分峰面積RSD分別為1.0%、0.99%、0.90%、0.85%、1.1%（n＝12）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下分析條件分別于0、1、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，結(jié)果豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸峰面積的RSD分別為1.1%、1.1%、1.2%、1.0%、1.3%（n＝7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)20011803 的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算樣品中豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的平均含量分別為3.11、3.21、0.55、5.25、0.36 mg·mL－1，RSD分別為1.1%、1.1%、1.3%、1.0%、1.3%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 檢測(cè)限和定量限 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下分析條件測(cè)定，以信噪比（S/N）約為3 和10 時(shí)分別計(jì)算豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表2。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品（批號(hào)：20011803）1 mL 置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋定容，取1 mL 置100 mL 量瓶，共6 份，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，用甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，平均加樣回收率分別為99.6%、99.4%、98.5%、99.8%、98.7%；RSD分別為1.1%、0.98%、1.5%、0.83%、2.0%（n＝6）。

2.4 樣品含量測(cè)定

取清開靈注射液樣品6 批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n＝2，mg·mL－1)Tab 3 Content determination of samples (n＝2，mg·mL－1)

3 討論

曾用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相體系，結(jié)果黃芩苷峰形拖尾嚴(yán)重，響應(yīng)值低。而使用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)黃芩苷峰形較好，響應(yīng)值穩(wěn)定且更高，因此本方法采用甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol·L－1甲酸銨溶液作為流動(dòng)相。

在正、負(fù)離子模式同時(shí)掃描時(shí)，黃芩苷和綠原酸在兩種模式下均有明顯的響應(yīng)值，黃芩苷在正離子模式下響應(yīng)值更高，而綠原酸在負(fù)離子模式下響應(yīng)值更高。豬去氧膽酸分子量為392.6，[M-H]－離子為m/z391.6，使用質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行掃描，未發(fā)現(xiàn)其特征性的子離子碎片，參考文獻(xiàn)[8]選擇m/z391.6→391.6 作為豬去氧膽酸的檢測(cè)離子對(duì)，并得到了良好的色譜峰和響應(yīng)值。

批號(hào)20041505 與批號(hào)20030601 的樣品綠原酸含量測(cè)定結(jié)果相差較大，可能是由于金銀花不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同批次所含綠原酸量差異所導(dǎo)致。

本方法可以在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定豬去氧膽酸、膽酸、梔子苷、黃芩苷、綠原酸的含量，色譜分離效果好，具有高靈敏度、高專屬性、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的特點(diǎn)，相較高效液相色譜法在定性定量方面更為準(zhǔn)確，為清開靈注射液5 種主要成分含量的分析提供了便捷有效的質(zhì)控方案。