任曉蕾，莊巖，劉華石，霍金海（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，哈爾濱 150036）

風(fēng)訶止咳顆粒為本院獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥產(chǎn)品，以本院臨床使用多年的治療咳喘的醫(yī)院制劑為基礎(chǔ)，由防風(fēng)、訶子、梔子、山楂、甘草等8 味中藥組成，具有止咳、平喘、化痰、利咽之功效，對(duì)痰內(nèi)伏于肺引起的咳嗽、咳吐不利、痰黏難出、呼吸急促、喉間哮鳴、咽痛等癥狀均有顯著療效。為了對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究建立風(fēng)訶止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中訶子、梔子、山楂、甘草進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定制劑防風(fēng)藥材中升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素的含量，提高原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為開(kāi)發(fā)治療咽痛咳喘的中藥新藥風(fēng)訶止咳顆粒奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀、Waters 2489 型紫外檢測(cè)器（美國(guó)沃特世），KQ-300DB 超聲清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司），BP211D 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司），HWS26 型水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201519，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；訶子（批號(hào)：DZYC-K-003）、山楂（批號(hào)：DZYC-S-022）對(duì)照藥材（成都彼斯特生物科技有限公司）；甘草苷（批號(hào)：G-009-161230）、梔子苷（批號(hào)：RFS-Z00311802022）、升麻苷（批號(hào)：S-004-150421）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)：J-002-150420）、升麻素（批號(hào)：S-007-150421）、亥茅酚苷（批號(hào)：H-027-150915）、花椒毒素（批號(hào)：H-035-150729）（對(duì)照品，純度＞98%，成都彼斯特生物科技有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純（德國(guó)默克），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 訶子的薄層鑒別[1-2]

取本品8 g，加無(wú)水乙醇30 mL，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含訶子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末8 g，同法制成陰性樣品溶液。另取訶子對(duì)照藥材1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述2 種溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 訶子薄層色譜Fig 1 TLC chromatogram of Terminalia chebula Retz.

2.2 甘草的薄層鑒別[3-5]

取本品10 g，加乙醚60 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，棄去乙醚液，殘?jiān)蛹状?0 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，以正丁醇震搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3 次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200 目，15 g，內(nèi)徑為1.5 cm），用40%甲醇150 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含甘草藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。另取甘草對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取甘草苷對(duì)照品，加甲醇制成每l mL 含2 mg 的溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、甘草對(duì)照藥材、甘草對(duì)照品溶液上述4 種溶液各10 μL，對(duì)照品溶液5 μL 分別點(diǎn)于同一塊硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 甘草薄層色譜Fig 2 TLC chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

2.3 梔子的薄層鑒別

取本品10 g，加50%甲醇25 mL，超聲處理40 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。按處方制備不含梔子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對(duì)照藥材l g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取梔子苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 梔子薄層色譜Fig 3 TLC chromatogram of Gardenia jasminoides Elli

2.4 山楂的薄層鑒別

取本品10 g，加水60 mL，加熱回流2.5 h，濾過(guò)蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含山楂藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對(duì)照藥材l g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（5∶2.5∶6）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，在105℃加熱，至呈紫紅斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 山楂薄層色譜Fig 4 TLC chromatogram of Crataegus pinnatifida Bge.

2.5 HPLC 法測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～15 min，65%A；15～25 min，65%～45%A；25～35 min，45%A；35～40 min，45%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫30℃；流速1.0 mg·mL－1；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素，加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為4000、2800、640、720、80 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品和陰性樣品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，回流提取40 min，取出，放至室溫，稱重，以甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按處方制備不含防風(fēng)藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末1 g，同法制成陰性樣品溶液。

2.5.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下，5 種成分能較好分離，且陰性樣品溶液無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 風(fēng)訶止咳顆粒的高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 5 batches of Fenghe zhike granules

2.5.5 線性關(guān)系考察 按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制混合對(duì)照品溶液，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷、花椒毒素的系列質(zhì)量濃度作為線性溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系Tab 1 Linearity

2.5.6 精密度試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素的RSD值分別為0.48%、1.4%、1.1%、0.90%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6 份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD分別為0.73%、1.6%、1.0%、0.85%、1.8%，結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定峰面積，結(jié)果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD值分別為0.20%、0.46%、1.4%、0.85%、2.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量樣品6 份，按含量1∶1，分別精密加入升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，計(jì)算平均回收率分別為96.8%、97.9%、95.1%、96.5%、95.8%，RSD值分別為2.2%、2.0%、1.3%、2.7%、2.7%。

2.6 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素平均含量分別為0.88、0.21、0.03、0.09及0.0067 mg·g－1。

3 討論

3.1 制劑中訶子薄層研究

預(yù)試驗(yàn)按照2020年版《中國(guó)藥典》一部訶子項(xiàng)下薄層條件，以甲苯-冰醋酸-水（12∶10∶0.4）為展開(kāi)劑，分別于日光及紫外365 nm 下檢視，特征斑點(diǎn)不明顯且陰性樣品有干擾；經(jīng)摸索將展開(kāi)劑調(diào)整為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1），噴以10%硫酸乙醇溶液，對(duì)照藥材主斑點(diǎn)顯色清晰Rf值適中，供試品溶液相應(yīng)位置斑點(diǎn)達(dá)到較好分離且陰性樣品無(wú)干擾。

3.2 制劑中甘草薄層研究

前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中甘草藥材的薄層鑒別方法較難除去背景干擾，采用正丁醇提取后上中性氧化鋁柱，對(duì)照藥材、對(duì)照品及供試品色譜相應(yīng)位置顯相同亮黃色特異性斑點(diǎn)且陰性樣品無(wú)干擾，分離度好且Rf值適中，方法簡(jiǎn)便易操作且，專屬性強(qiáng)，可供其他復(fù)方中甘草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

3.3 制劑中防風(fēng)成分相關(guān)研究

防風(fēng)通過(guò)其疏風(fēng)解表之功達(dá)清熱利咽之效，宣肺散風(fēng)止咳。升麻苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷具有顯著的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗凝作用，亥茅酚苷也具有一定的鎮(zhèn)痛作用[6-8]。李悅悅等[9-10]通過(guò)RRLC-TOF/MS 分析防風(fēng)入血、尿液成分發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)中含量高的升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷入血量很少，反而在血漿和尿液中含量最高的成分是升麻素，推測(cè)升麻素為防風(fēng)主要代謝形式，升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷等苷類物質(zhì)主要轉(zhuǎn)化為升麻素（苷元）后才能入血被吸收，因此升麻素在防風(fēng)藥效發(fā)揮中的作用也相當(dāng)重要，對(duì)其含量測(cè)定具有一定意義。花椒毒素是防風(fēng)香豆素類化合物中的一種，具有抗炎、抗菌、抗過(guò)敏、抗凝、止血、祛痰等作用，在防風(fēng)主要功效的發(fā)揮中也有一定作用，因此對(duì)以上5種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

本文針對(duì)所有藥材建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層及液相色譜針對(duì)每味藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，以提高復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。