秦鵬，柏玉冰，唐鋒，李洪權(quán)（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 40007；2.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 42000）

葉下珠為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草，收載于各地方標(biāo)準(zhǔn)，性微苦、涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱、利濕、解毒、消腫的功效[1-4]。葉下珠含有木脂素[5]、香豆素[6]、萜類(lèi)[7-8]、黃酮[9]、酚酸[10]、有機(jī)酸[11]、生物堿[12]等成分，具有抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗菌[15]、抗氧化[16]及護(hù)肝[17]等藥理作用。

根據(jù)已有活性研究可知，抗病毒的作用成分為柯里拉京等[18]，抗菌的作用成分為柯里拉京、沒(méi)食子酸和原兒茶酸等[19-20]，抗腫瘤的作用成分為柯里拉京、蘆丁、槲皮素和山柰酚等[21-23]，抗氧化的作用成分為柯里拉京、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、槲皮素和山柰酚等[24-26]，護(hù)肝的作用成分為短葉蘇木酚等[27]。

為準(zhǔn)確把握葉下珠的用法用量，對(duì)這些功效成分進(jìn)行含量測(cè)定是必不可少的。目前已有研究中對(duì)這些成分建立了含量測(cè)定方法[28-33]，但這些方法仍有可改進(jìn)之處，如在分析多成分時(shí)為達(dá)到一定分離度，信號(hào)采集時(shí)間較長(zhǎng)[28-29]；單次分析成分?jǐn)?shù)量較少[30-32]；方法靈敏度不高[33]等。這些都可能影響含量測(cè)定的高效性和準(zhǔn)確性。而基于質(zhì)荷比分析的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法幾乎不依賴(lài)于峰與峰之間的分離度，信號(hào)采集時(shí)間短，靈敏度高[34]，可優(yōu)化上述問(wèn)題。且目前尚未發(fā)現(xiàn)有基于此方法對(duì)葉下珠中上述功效成分進(jìn)行含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究特基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立葉下珠中7 種功效成分的含量測(cè)定方法，以期更高效、準(zhǔn)確地測(cè)定其含量。

1 材料

1.1 試藥

槲皮素（純度：97.4%，批號(hào)：100081-200907）、山柰酚（純度：95.9%，批號(hào)：110861-200808）、蘆?。兌龋?0.5%，批號(hào)：100080-200707）、原兒茶酸（純度：99.9%，批號(hào)：110809-201205）、沒(méi)食子酸（純度：91.5%，批號(hào)：110831-201906）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；柯里拉京（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度：98.0%，批號(hào)：A0647）；短葉蘇木酚（長(zhǎng)沙誠(chéng)邦生物科技有限公司，純度：98.0%，批號(hào)：20032403）；乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾有限公司）；甲酸、乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。葉下珠樣品信息見(jiàn)表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所胡冠宇主管藥師鑒定均為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草。所有批次藥材均經(jīng)粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，備用。

表1 樣品信息Tab 1 Information of sample

1.2 儀器

XSE 205DV 電子天平（精度：0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司）；HNS-SY-150 超聲波儀（40 kHz，400 W，北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜（上海愛(ài)博才思分析儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Welch xtimate C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～6 min，10%→85%B；6～8 min，85%→95%B；8～8.5 min，95%→10%B；8.5～10.0 min，10%B），流速0.8 mL·min－1，采集時(shí)間為10 min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），離子源溫度：550 ℃，電噴霧電壓：－4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 負(fù)離子模式下7 種成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 7 components in the neagtive ion mode

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取不同質(zhì)量的柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸、沒(méi)食子酸對(duì)照品，置25 mL 棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算，上述各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.260、0.130、0.500、0.320、0.700、0.300 mg·mL－1。對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 葉下珠混合對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖Fig 1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.mixture reference

2.3.2 供試品溶液 取葉下珠粉末（粉碎后過(guò)4 號(hào)篩），置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液40 mL，稱(chēng)量，超聲（400 W，40 kHz）提取20 min，靜置至室溫，再稱(chēng)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖Fig 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.sample

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用70%甲醇溶液稀釋得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液（柯里拉京：0.500～50.0 μg·mL－1；短葉蘇木酚：0.0260～2.60 μg·mL－1；槲皮素：0.001 30～0.130 μg·mL－1；山柰酚：0.005 00～0.500 μg·mL－1；蘆?。?.320～32.0 μg·mL－1；原兒茶酸：0.007 00～0.700 μg·mL－1；沒(méi)食子酸：0.300～30.0 μg·mL－1），按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度C（ng·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算7 個(gè)成分的線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系結(jié)果(n＝7)Tab 3 Linearity of the 7 components (n＝7)

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為0.65%、0.88%、0.72%、0.89%、0.76%、0.60%和0.73%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（1 號(hào)樣品），稱(chēng)取6 份，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為1.0%、1.2%、1.3%、1.5%、1.2%、1.4%和1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（1 號(hào)樣品）的供試品溶液，分別于0、2、4、8 和12 h 進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為2.0%、2.0%、2.0%、1.8%、2.5%、2.1%和1.9%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品（1 號(hào)樣品）6 份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入絕對(duì)含量接近0.5 g 藥材所含含量的對(duì)照品溶液后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸的平均回收率分別為98.6%、103.8%、100.4%、101.3%、100.8%、99.6%和98.1%，RSD分別為1.6%、1.3%、1.7%、2.2%、1.8%、2.0%和1.6%，表明本方法回收率良好。

2.5 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取6 批次不同批號(hào)的葉下珠各2 份，分別按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，代入線性回歸方程計(jì)算7 種成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 6 批次樣品7 種成分的含量(μg·g－1，n＝2)Tab 4 Contents of the 7 components in 6 batches of samples (μg·g－1，n＝2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件考察

3.1.1 提取溶劑的比較 本研究比較了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇作為提取溶劑，以7 種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定最佳提取溶劑。結(jié)果當(dāng)甲醇濃度為70%時(shí)，7 種成分的峰面積均達(dá)到最大值。因此，選擇70%甲醇為提取溶劑。

3.1.2 提取時(shí)間的比較 本研究比較了10、20和30 min 的提取時(shí)間，以7 種成分的峰面積不再增加為判斷依據(jù)，確定最佳提取時(shí)間。結(jié)果7 種成分均在提取20 min 時(shí)達(dá)到最大值。而當(dāng)提取時(shí)間為30 min 時(shí)，部分成分含量不增反降，尤其是原兒茶酸和沒(méi)食子酸，這可能是由于隨著超聲時(shí)間的增加，水溫升高，促使部分酚酸被氧化。因此，20 min 為最佳提取時(shí)間。

3.1.3 提取體積的比較 本研究比較了30、40和50 mL 的提取體積，以7 種成分的峰面積與其提取所加入溶劑體積的乘積達(dá)到上限為判斷依據(jù)，確定最佳提取體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取體積為40 mL 時(shí)，其峰面積與提取時(shí)所加入溶劑的體積的乘積已經(jīng)達(dá)到上限，因此，40 mL 為最佳提取體積。

3.2 色譜條件優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 本研究比較了兩種不同的色譜柱，Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以7 種成分的分子離子峰的保留性和峰形等因素為判斷依據(jù)，確定更為合適的色譜柱。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，兩款色譜柱均獲得了較為合適的保留時(shí)間和較好的峰形，但仍有區(qū)別。當(dāng)使用Thermo Acclaim 120 C18柱時(shí)，原兒茶酸、沒(méi)食子酸、短葉蘇木酚和柯里拉京峰稍有前延，槲皮素和山柰酚峰稍有拖尾；而當(dāng)使用Welch Xtimate C18色譜柱，峰形均未出現(xiàn)峰拖尾和前延的現(xiàn)象。因此，選擇Welch Xtimate C18色譜柱較為合適。

3.2.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 本研究比較了3 種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，包括乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù)，確定更為合適的流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，槲皮素、沒(méi)食子酸稍有拖尾；當(dāng)選擇乙腈-0.1%甲酸溶液水作為流動(dòng)相時(shí)，短葉蘇木酚稍有拖尾；而選擇以乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，峰形均較為對(duì)稱(chēng)。因此，選擇乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液較為合適。

3.2.3 水相起始比例的選擇 本研究比較了水相90%、70%和50% 3 種不同起始比例，以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù)，確定最佳水相起始比例。發(fā)現(xiàn)不同起始比例情況下，峰形差異較大。當(dāng)水相起始比例為90%時(shí)，各峰峰形較好；當(dāng)起始比例降低至70%時(shí)，7 種成分的峰形變差，出現(xiàn)不同程度的峰前延和拖尾現(xiàn)象；當(dāng)降低至50%時(shí)，峰前延和拖尾現(xiàn)象加劇，尤其是原兒茶酸、沒(méi)食子酸的峰前延和槲皮素、山柰酚峰拖尾現(xiàn)象，甚至，柯里拉京出現(xiàn)峰分叉的現(xiàn)象。因此，選擇90%的水相作為起始比例較為合適。

3.3 總結(jié)

綜上，基于上述供試液制備條件的考察、色譜條件的優(yōu)化、質(zhì)譜參數(shù)的建立及方法學(xué)考察等，本研究首次建立了葉下珠中柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸7 種成分的UPLC-MS/MS 含量測(cè)定方法。本方法的完成，可更為高效、準(zhǔn)確地測(cè)定葉下珠中多種成分的含量，為基于這些成分的葉下珠藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。