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        超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定葉下珠中7種成分的含量

        2021-09-01 03:13:56秦鵬柏玉冰唐鋒李洪權(quán)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部長(zhǎng)沙40007株洲市食品藥品檢驗(yàn)所湖南株洲42000
        中南藥學(xué) 2021年7期

        秦鵬,柏玉冰,唐鋒,李洪權(quán)(.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)沙 40007;2.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所,湖南 株洲 42000)

        葉下珠為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草,收載于各地方標(biāo)準(zhǔn),性微苦、涼,歸肝、脾經(jīng),具有清熱、利濕、解毒、消腫的功效[1-4]。葉下珠含有木脂素[5]、香豆素[6]、萜類(lèi)[7-8]、黃酮[9]、酚酸[10]、有機(jī)酸[11]、生物堿[12]等成分,具有抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗菌[15]、抗氧化[16]及護(hù)肝[17]等藥理作用。

        根據(jù)已有活性研究可知,抗病毒的作用成分為柯里拉京等[18],抗菌的作用成分為柯里拉京、沒(méi)食子酸和原兒茶酸等[19-20],抗腫瘤的作用成分為柯里拉京、蘆丁、槲皮素和山柰酚等[21-23],抗氧化的作用成分為柯里拉京、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、槲皮素和山柰酚等[24-26],護(hù)肝的作用成分為短葉蘇木酚等[27]。

        為準(zhǔn)確把握葉下珠的用法用量,對(duì)這些功效成分進(jìn)行含量測(cè)定是必不可少的。目前已有研究中對(duì)這些成分建立了含量測(cè)定方法[28-33],但這些方法仍有可改進(jìn)之處,如在分析多成分時(shí)為達(dá)到一定分離度,信號(hào)采集時(shí)間較長(zhǎng)[28-29];單次分析成分?jǐn)?shù)量較少[30-32];方法靈敏度不高[33]等。這些都可能影響含量測(cè)定的高效性和準(zhǔn)確性。而基于質(zhì)荷比分析的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法幾乎不依賴(lài)于峰與峰之間的分離度,信號(hào)采集時(shí)間短,靈敏度高[34],可優(yōu)化上述問(wèn)題。且目前尚未發(fā)現(xiàn)有基于此方法對(duì)葉下珠中上述功效成分進(jìn)行含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。

        因此,本研究特基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法建立葉下珠中7 種功效成分的含量測(cè)定方法,以期更高效、準(zhǔn)確地測(cè)定其含量。

        1 材料

        1.1 試藥

        槲皮素(純度:97.4%,批號(hào):100081-200907)、山柰酚(純度:95.9%,批號(hào):110861-200808)、蘆?。兌龋?0.5%,批號(hào):100080-200707)、原兒茶酸(純度:99.9%,批號(hào):110809-201205)、沒(méi)食子酸(純度:91.5%,批號(hào):110831-201906)(中國(guó)食品藥品檢定研究院);柯里拉京(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司,純度:98.0%,批號(hào):A0647);短葉蘇木酚(長(zhǎng)沙誠(chéng)邦生物科技有限公司,純度:98.0%,批號(hào):20032403);乙腈、甲醇(色譜純,霍尼韋爾有限公司);甲酸、乙酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。葉下珠樣品信息見(jiàn)表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗(yàn)所胡冠宇主管藥師鑒定均為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草。所有批次藥材均經(jīng)粉碎后過(guò)4 號(hào)篩,備用。

        表1 樣品信息Tab 1 Information of sample

        1.2 儀器

        XSE 205DV 電子天平(精度:0.01 mg,梅特勒托利多儀器有限公司);HNS-SY-150 超聲波儀(40 kHz,400 W,北京恒奧德儀器儀表有限公司);Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜(上海愛(ài)博才思分析儀器有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        采用 Welch xtimate C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以含10 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~6 min,10%→85%B;6~8 min,85%→95%B;8~8.5 min,95%→10%B;8.5~10.0 min,10%B),流速0.8 mL·min-1,采集時(shí)間為10 min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量2 μL。

        2.2 質(zhì)譜條件

        電噴霧電離源(ESI),負(fù)離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),離子源溫度:550 ℃,電噴霧電壓:-4500 V,氣簾氣:35.0 psi,離子源氣1:55 psi,離子源氣2:55 psi,碰撞氣:氬氣。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

        表2 負(fù)離子模式下7 種成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 7 components in the neagtive ion mode

        2.3 溶液的制備

        2.3.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取不同質(zhì)量的柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸、沒(méi)食子酸對(duì)照品,置25 mL 棕色量瓶中,加70%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得。經(jīng)含量折算,上述各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.260、0.130、0.500、0.320、0.700、0.300 mg·mL-1。對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

        圖1 葉下珠混合對(duì)照品總離子流和提取離子色譜圖Fig 1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.mixture reference

        2.3.2 供試品溶液 取葉下珠粉末(粉碎后過(guò)4 號(hào)篩),置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇溶液40 mL,稱(chēng)量,超聲(400 W,40 kHz)提取20 min,靜置至室溫,再稱(chēng)量,用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖見(jiàn)圖2。

        圖2 葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖Fig 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.sample

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用70%甲醇溶液稀釋得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液(柯里拉京:0.500~50.0 μg·mL-1;短葉蘇木酚:0.0260~2.60 μg·mL-1;槲皮素:0.001 30~0.130 μg·mL-1;山柰酚:0.005 00~0.500 μg·mL-1;蘆?。?.320~32.0 μg·mL-1;原兒茶酸:0.007 00~0.700 μg·mL-1;沒(méi)食子酸:0.300~30.0 μg·mL-1),按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定,以質(zhì)量濃度C(ng·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),計(jì)算7 個(gè)成分的線性回歸方程,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 線性關(guān)系結(jié)果(n=7)Tab 3 Linearity of the 7 components (n=7)

        2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液,按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次,記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為0.65%、0.88%、0.72%、0.89%、0.76%、0.60%和0.73%,表明儀器精密度良好。

        2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(1 號(hào)樣品),稱(chēng)取6 份,按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為1.0%、1.2%、1.3%、1.5%、1.2%、1.4%和1.4%,表明方法重復(fù)性良好。

        2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(1 號(hào)樣品)的供試品溶液,分別于0、2、4、8 和12 h 進(jìn)樣分析,記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為2.0%、2.0%、2.0%、1.8%、2.5%、2.1%和1.9%,表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品(1 號(hào)樣品)6 份,每份約0.5 g,精密稱(chēng)定,分別加入絕對(duì)含量接近0.5 g 藥材所含含量的對(duì)照品溶液后,按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸的平均回收率分別為98.6%、103.8%、100.4%、101.3%、100.8%、99.6%和98.1%,RSD分別為1.6%、1.3%、1.7%、2.2%、1.8%、2.0%和1.6%,表明本方法回收率良好。

        2.5 樣品測(cè)定

        精密稱(chēng)取6 批次不同批號(hào)的葉下珠各2 份,分別按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定,代入線性回歸方程計(jì)算7 種成分含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 6 批次樣品7 種成分的含量(μg·g-1,n=2)Tab 4 Contents of the 7 components in 6 batches of samples (μg·g-1,n=2)

        3 討論

        3.1 供試品溶液制備條件考察

        3.1.1 提取溶劑的比較 本研究比較了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇作為提取溶劑,以7 種成分的峰面積大小為判斷依據(jù),確定最佳提取溶劑。結(jié)果當(dāng)甲醇濃度為70%時(shí),7 種成分的峰面積均達(dá)到最大值。因此,選擇70%甲醇為提取溶劑。

        3.1.2 提取時(shí)間的比較 本研究比較了10、20和30 min 的提取時(shí)間,以7 種成分的峰面積不再增加為判斷依據(jù),確定最佳提取時(shí)間。結(jié)果7 種成分均在提取20 min 時(shí)達(dá)到最大值。而當(dāng)提取時(shí)間為30 min 時(shí),部分成分含量不增反降,尤其是原兒茶酸和沒(méi)食子酸,這可能是由于隨著超聲時(shí)間的增加,水溫升高,促使部分酚酸被氧化。因此,20 min 為最佳提取時(shí)間。

        3.1.3 提取體積的比較 本研究比較了30、40和50 mL 的提取體積,以7 種成分的峰面積與其提取所加入溶劑體積的乘積達(dá)到上限為判斷依據(jù),確定最佳提取體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取體積為40 mL 時(shí),其峰面積與提取時(shí)所加入溶劑的體積的乘積已經(jīng)達(dá)到上限,因此,40 mL 為最佳提取體積。

        3.2 色譜條件優(yōu)化

        3.2.1 色譜柱的選擇 本研究比較了兩種不同的色譜柱,Welch Xtimate C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)和Thermo Acclaim 120 C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),以7 種成分的分子離子峰的保留性和峰形等因素為判斷依據(jù),確定更為合適的色譜柱。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,兩款色譜柱均獲得了較為合適的保留時(shí)間和較好的峰形,但仍有區(qū)別。當(dāng)使用Thermo Acclaim 120 C18柱時(shí),原兒茶酸、沒(méi)食子酸、短葉蘇木酚和柯里拉京峰稍有前延,槲皮素和山柰酚峰稍有拖尾;而當(dāng)使用Welch Xtimate C18色譜柱,峰形均未出現(xiàn)峰拖尾和前延的現(xiàn)象。因此,選擇Welch Xtimate C18色譜柱較為合適。

        3.2.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 本研究比較了3 種不同的流動(dòng)相系統(tǒng),包括乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含10 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液,以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù),確定更為合適的流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí),槲皮素、沒(méi)食子酸稍有拖尾;當(dāng)選擇乙腈-0.1%甲酸溶液水作為流動(dòng)相時(shí),短葉蘇木酚稍有拖尾;而選擇以乙腈-含10 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí),峰形均較為對(duì)稱(chēng)。因此,選擇乙腈-含10 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液較為合適。

        3.2.3 水相起始比例的選擇 本研究比較了水相90%、70%和50% 3 種不同起始比例,以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù),確定最佳水相起始比例。發(fā)現(xiàn)不同起始比例情況下,峰形差異較大。當(dāng)水相起始比例為90%時(shí),各峰峰形較好;當(dāng)起始比例降低至70%時(shí),7 種成分的峰形變差,出現(xiàn)不同程度的峰前延和拖尾現(xiàn)象;當(dāng)降低至50%時(shí),峰前延和拖尾現(xiàn)象加劇,尤其是原兒茶酸、沒(méi)食子酸的峰前延和槲皮素、山柰酚峰拖尾現(xiàn)象,甚至,柯里拉京出現(xiàn)峰分叉的現(xiàn)象。因此,選擇90%的水相作為起始比例較為合適。

        3.3 總結(jié)

        綜上,基于上述供試液制備條件的考察、色譜條件的優(yōu)化、質(zhì)譜參數(shù)的建立及方法學(xué)考察等,本研究首次建立了葉下珠中柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒(méi)食子酸7 種成分的UPLC-MS/MS 含量測(cè)定方法。本方法的完成,可更為高效、準(zhǔn)確地測(cè)定葉下珠中多種成分的含量,為基于這些成分的葉下珠藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。

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