辜慧，李道霞，何成軍，杜鋼（四川省食品檢驗(yàn)研究院，成都 611731）

口服液體制劑易被微生物污染而發(fā)霉變質(zhì)，為保障該類(lèi)制劑臨床用藥安全，需添加適量的防腐劑，抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到有效的防腐目的。另外，還需添加適量甜味劑及色素，改善制劑口感及外觀(guān)，提高患者依從性[1]。然而，添加劑的超范圍使用、過(guò)量添加會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害。人工合成色素、甜味劑和防腐劑在市場(chǎng)上已有濫用的趨勢(shì)，給藥品安全帶來(lái)了隱患，對(duì)消費(fèi)者的健康造成了直接的威脅。目前，國(guó)內(nèi)口服液體制劑生產(chǎn)企業(yè)眾多，所加添加劑的種類(lèi)與濃度亦各不相同，關(guān)于添加劑的測(cè)定方法文獻(xiàn)均有報(bào)道[2-7]，未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定人工合成色素、甜味劑和防腐劑的方法報(bào)道。為了提高檢驗(yàn)效率，節(jié)約成本，更全面地控制口服液體制劑的安全性，本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定口服液體制劑中12種添加劑的高效液相色譜（HPLC）法。

1 儀器與試藥

LC-20AT 型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（日本SHIMADZU 公司）；ME204 分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士METTLER TOLEDO 公司）；FB15065 超聲波發(fā)生器（美國(guó)Fisher 公司）；Milli-Q 型高純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore 公司）；苯甲酸（批號(hào)：B0001649，濃度：1000 μg·mL－1）、山梨酸（批號(hào)：B0002741，濃度：1000 μg·mL－1）、酸性紅（批號(hào)：C0005676，純度：90.7%）、脫氫乙酸（批號(hào)：B0003452，純度：99.9%）、糖精鈉（批號(hào)：B0001955，濃度：1000 μg·mL－1）（BePure）；檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、誘惑紅及亮藍(lán)（A CHEMTEK INC，批號(hào)：S027451，濃度：1000 μg·mL－1）；甲醇、乙酸銨（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相A 為20 mmol·L－1乙酸銨溶液，流動(dòng)相B 為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取酸性紅、脫氫乙酸對(duì)照品約10 mg，分別置10 mL 量瓶中，用水超聲溶解并定容至刻度，搖勻，分別作為酸性紅對(duì)照品儲(chǔ)備液、脫氫乙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。其余組份對(duì)照品儲(chǔ)備液均從對(duì)照品公司購(gòu)得。再分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置同一50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 以布洛芬混懸液為例，精密量取樣品1 mL，置10 mL 量瓶中，加水適量，超聲處理10 min，再加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 取陰性樣品（蛋白酶合劑）按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性考察 分別量取“2.2”項(xiàng)下的空白溶劑（水）、混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果色譜圖基線(xiàn)穩(wěn)定，峰形對(duì)稱(chēng)，分離度較好，各峰保留時(shí)間適中，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需要，說(shuō)明本試驗(yàn)的專(zhuān)屬性良好。

圖1 典型HPLC 色譜圖Fig 1 Typical chromatogram by HPLC

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取不同體積的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，加水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，以各組分的峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 檢測(cè)限及定量限考察 取混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣10 μL，當(dāng)峰高為基線(xiàn)噪音的3 和10 倍量時(shí)，測(cè)得各添加劑的檢測(cè)限及定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12 種添加劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢測(cè)限與定量限Tab 2 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOD and LOQ for 12 additives

2.3.4 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，苯甲酸等12 種添加劑峰面積的RSD為0.11%～0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性考察 取一批樣品（檢出檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅），按“2.2.2”項(xiàng)下方法前處理，平行制備6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，計(jì)算得樣品中檸檬黃平均含量為0.52 μg·mL－1，莧菜紅平均含量為3.11 μg·mL－1，胭脂紅平均含量為5.88 μg·mL－1，RSD分別為1.8%、1.4%、0.99%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收試驗(yàn) 以未檢出添加劑的陰性樣品為基質(zhì)，按低、中、高濃度分別精密加入混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為20 μg·mL－1）0.5、1.0、5.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，制備約相當(dāng)于1、2、5 μg·mL－1的回收試驗(yàn)溶液，每個(gè)濃度平行制備6 份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 12 種添加劑的平均回收率(n＝6)Tab 3 Average recovery of 12 additives (n＝6)

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取回收試驗(yàn)中的低、中、高濃度的溶液，室溫放置，分別于0、6、12、24、48 h 進(jìn)樣，各組分峰面積的RSD均小于2.0%，表明12 種添加劑在48 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

2.3.8 樣品測(cè)定 取10 批抽檢的口服液體制劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 口服液體制劑中檢測(cè)出的各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg·mL－1，n＝3)Tab 4 Content determination of various constituent in oral liquid preparations (μg·mL－1，n＝3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

液相色譜方法測(cè)定目標(biāo)化合物時(shí)，多在流動(dòng)相中加入緩沖鹽，試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫程序獲得合適的保留時(shí)間、峰形以及分離效果。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8-10]，流動(dòng)相選擇乙酸銨溶液-甲醇系統(tǒng)，考察了流動(dòng)相中乙酸銨的質(zhì)量濃度分別為10、20、50 mmol·L－1時(shí)對(duì)12 種添加劑色譜行為的影響。結(jié)果表明乙酸銨質(zhì)量濃度為20 mmol·L－1時(shí)，12 種添加劑的色譜峰峰形尖銳，分離度較好。故最終選擇流動(dòng)相為20 mmol·L－1乙酸銨溶液-甲醇體系，該流動(dòng)相體系也可在檢出添加劑后，直接用于LC-MS/MS 作進(jìn)一步分析確認(rèn)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確認(rèn)

利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)分別進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸最大吸收波長(zhǎng)均在紫外光區(qū)，檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)雖然最大吸收波長(zhǎng)均在可見(jiàn)光區(qū)，但紫外光區(qū)也有較強(qiáng)吸收。綜合分析12 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收曲線(xiàn)，各組分在 220～240 nm 均有較強(qiáng)吸收，故選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下基線(xiàn)平穩(wěn)、噪聲小，各組分均具有較高靈敏度。

3.3 色譜柱的選擇

本文參考文獻(xiàn)[10-12]，考察了色譜柱Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）對(duì)目標(biāo)化合物分離度及峰形的影響，最終選擇 Waters XBridge C18色譜柱，結(jié)果12 個(gè)目標(biāo)化合物可以達(dá)到分離測(cè)定的要求，且準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。

3.4 其他

本試驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定口服液體制劑中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)的含量，該方法操作簡(jiǎn)便、精密度好、回收率高，能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，適用于口服液體制劑中人工合成色素、甜味劑和防腐劑的檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)一些藥品中仍存在著添加劑濫用的現(xiàn)象，存在較大的安全隱患，需要進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管。