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        高效液相色譜法測(cè)定口服液體制劑中12種添加劑的含量

        2021-09-01 03:13:54辜慧李道霞何成軍杜鋼四川省食品檢驗(yàn)研究院成都611731
        中南藥學(xué) 2021年7期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        辜慧,李道霞,何成軍,杜鋼(四川省食品檢驗(yàn)研究院,成都 611731)

        口服液體制劑易被微生物污染而發(fā)霉變質(zhì),為保障該類(lèi)制劑臨床用藥安全,需添加適量的防腐劑,抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖,達(dá)到有效的防腐目的。另外,還需添加適量甜味劑及色素,改善制劑口感及外觀(guān),提高患者依從性[1]。然而,添加劑的超范圍使用、過(guò)量添加會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害。人工合成色素、甜味劑和防腐劑在市場(chǎng)上已有濫用的趨勢(shì),給藥品安全帶來(lái)了隱患,對(duì)消費(fèi)者的健康造成了直接的威脅。目前,國(guó)內(nèi)口服液體制劑生產(chǎn)企業(yè)眾多,所加添加劑的種類(lèi)與濃度亦各不相同,關(guān)于添加劑的測(cè)定方法文獻(xiàn)均有報(bào)道[2-7],未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定人工合成色素、甜味劑和防腐劑的方法報(bào)道。為了提高檢驗(yàn)效率,節(jié)約成本,更全面地控制口服液體制劑的安全性,本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定口服液體制劑中12種添加劑的高效液相色譜(HPLC)法。

        1 儀器與試藥

        LC-20AT 型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器(日本SHIMADZU 公司);ME204 分析天平(十萬(wàn)分之一,瑞士METTLER TOLEDO 公司);FB15065 超聲波發(fā)生器(美國(guó)Fisher 公司);Milli-Q 型高純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore 公司);苯甲酸(批號(hào):B0001649,濃度:1000 μg·mL-1)、山梨酸(批號(hào):B0002741,濃度:1000 μg·mL-1)、酸性紅(批號(hào):C0005676,純度:90.7%)、脫氫乙酸(批號(hào):B0003452,純度:99.9%)、糖精鈉(批號(hào):B0001955,濃度:1000 μg·mL-1)(BePure);檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、誘惑紅及亮藍(lán)(A CHEMTEK INC,批號(hào):S027451,濃度:1000 μg·mL-1);甲醇、乙酸銨(色譜純,美國(guó)Fisher 公司);水為超純水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:0.8 mL·min-1;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;進(jìn)樣體積:10 μL;流動(dòng)相A 為20 mmol·L-1乙酸銨溶液,流動(dòng)相B 為甲醇,梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

        表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution program

        2.2 溶液的配制

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取酸性紅、脫氫乙酸對(duì)照品約10 mg,分別置10 mL 量瓶中,用水超聲溶解并定容至刻度,搖勻,分別作為酸性紅對(duì)照品儲(chǔ)備液、脫氫乙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。其余組份對(duì)照品儲(chǔ)備液均從對(duì)照品公司購(gòu)得。再分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL,置同一50 mL 量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液 以布洛芬混懸液為例,精密量取樣品1 mL,置10 mL 量瓶中,加水適量,超聲處理10 min,再加水定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

        2.2.3 陰性樣品溶液 取陰性樣品(蛋白酶合劑)按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液,備用。

        2.3 方法學(xué)考察

        2.3.1 專(zhuān)屬性考察 分別量取“2.2”項(xiàng)下的空白溶劑(水)、混合對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。結(jié)果色譜圖基線(xiàn)穩(wěn)定,峰形對(duì)稱(chēng),分離度較好,各峰保留時(shí)間適中,能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需要,說(shuō)明本試驗(yàn)的專(zhuān)屬性良好。

        圖1 典型HPLC 色譜圖Fig 1 Typical chromatogram by HPLC

        2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取不同體積的各對(duì)照品儲(chǔ)備液,加水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,精密吸取10 μL 注入液相色譜儀,以各組分的峰面積Y為縱坐標(biāo),進(jìn)樣質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

        2.3.3 檢測(cè)限及定量限考察 取混合對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度,分別進(jìn)樣10 μL,當(dāng)峰高為基線(xiàn)噪音的3 和10 倍量時(shí),測(cè)得各添加劑的檢測(cè)限及定量限,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 12 種添加劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢測(cè)限與定量限Tab 2 Regression equation,correlation coefficient,linearity,LOD and LOQ for 12 additives

        2.3.4 精密度考察 取混合對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,苯甲酸等12 種添加劑峰面積的RSD為0.11%~0.85%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.3.5 重復(fù)性考察 取一批樣品(檢出檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅),按“2.2.2”項(xiàng)下方法前處理,平行制備6 份,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),計(jì)算得樣品中檸檬黃平均含量為0.52 μg·mL-1,莧菜紅平均含量為3.11 μg·mL-1,胭脂紅平均含量為5.88 μg·mL-1,RSD分別為1.8%、1.4%、0.99%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

        2.3.6 回收試驗(yàn) 以未檢出添加劑的陰性樣品為基質(zhì),按低、中、高濃度分別精密加入混合對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1)0.5、1.0、5.0 mL,按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理,制備約相當(dāng)于1、2、5 μg·mL-1的回收試驗(yàn)溶液,每個(gè)濃度平行制備6 份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算回收率及RSD,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 12 種添加劑的平均回收率(n=6)Tab 3 Average recovery of 12 additives (n=6)

        2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取回收試驗(yàn)中的低、中、高濃度的溶液,室溫放置,分別于0、6、12、24、48 h 進(jìn)樣,各組分峰面積的RSD均小于2.0%,表明12 種添加劑在48 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

        2.3.8 樣品測(cè)定 取10 批抽檢的口服液體制劑,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 口服液體制劑中檢測(cè)出的各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg·mL-1,n=3)Tab 4 Content determination of various constituent in oral liquid preparations (μg·mL-1,n=3)

        3 討論

        3.1 流動(dòng)相的選擇

        液相色譜方法測(cè)定目標(biāo)化合物時(shí),多在流動(dòng)相中加入緩沖鹽,試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫程序獲得合適的保留時(shí)間、峰形以及分離效果。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8-10],流動(dòng)相選擇乙酸銨溶液-甲醇系統(tǒng),考察了流動(dòng)相中乙酸銨的質(zhì)量濃度分別為10、20、50 mmol·L-1時(shí)對(duì)12 種添加劑色譜行為的影響。結(jié)果表明乙酸銨質(zhì)量濃度為20 mmol·L-1時(shí),12 種添加劑的色譜峰峰形尖銳,分離度較好。故最終選擇流動(dòng)相為20 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇體系,該流動(dòng)相體系也可在檢出添加劑后,直接用于LC-MS/MS 作進(jìn)一步分析確認(rèn)。

        3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確認(rèn)

        利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)分別進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸最大吸收波長(zhǎng)均在紫外光區(qū),檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)雖然最大吸收波長(zhǎng)均在可見(jiàn)光區(qū),但紫外光區(qū)也有較強(qiáng)吸收。綜合分析12 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收曲線(xiàn),各組分在 220~240 nm 均有較強(qiáng)吸收,故選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng),在此波長(zhǎng)下基線(xiàn)平穩(wěn)、噪聲小,各組分均具有較高靈敏度。

        3.3 色譜柱的選擇

        本文參考文獻(xiàn)[10-12],考察了色譜柱Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)對(duì)目標(biāo)化合物分離度及峰形的影響,最終選擇 Waters XBridge C18色譜柱,結(jié)果12 個(gè)目標(biāo)化合物可以達(dá)到分離測(cè)定的要求,且準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。

        3.4 其他

        本試驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定口服液體制劑中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、酸性紅、誘惑紅及亮藍(lán)的含量,該方法操作簡(jiǎn)便、精密度好、回收率高,能滿(mǎn)足檢測(cè)要求,適用于口服液體制劑中人工合成色素、甜味劑和防腐劑的檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)一些藥品中仍存在著添加劑濫用的現(xiàn)象,存在較大的安全隱患,需要進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管。

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