程智，王孝艷，雍子宜，2，謝華*（.四川省藥品檢驗(yàn)研究院，成都 673；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都60500）

富馬酸比索洛爾是目前臨床上治療心血管疾病常見(jiàn)的一種選擇性β1-腎上腺素受體拮抗劑[1-3]，在《中國(guó)藥典》2020年版（ChP2020）、美國(guó)藥典（USP42）、歐洲藥典（EP10.0）、英國(guó)藥典（BP2020）以及日本藥典（JP17）中均有收載。富馬酸比索洛爾片在ChP2020、美國(guó)藥典（USP42）、英國(guó)藥典（BP2020）以及日本藥典（JP17）中均有收載，國(guó)內(nèi)有批準(zhǔn)文號(hào)的3 家生產(chǎn)企業(yè)均通過(guò)了仿制藥一致性評(píng)價(jià)研究，并獲批了新的藥品標(biāo)準(zhǔn)[4-7]。富馬酸比索洛爾膠囊為我國(guó)特有劑型，只在ChP2020 中收載。

在有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方面，除美國(guó)藥典（USP42）在片劑中無(wú)規(guī)定外，其他標(biāo)準(zhǔn)均為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)提供了方法和參考，但各標(biāo)準(zhǔn)在已知雜質(zhì)、色譜條件和雜質(zhì)限度等方面均存在著很大的差異，特別是在國(guó)內(nèi)各企業(yè)通過(guò)仿制藥一致性評(píng)價(jià)獲得新的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)后，其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法及限度均高于ChP2020，故存在注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)與藥典并行檢驗(yàn)的情況。為統(tǒng)一和提高我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，參考國(guó)內(nèi)外各標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，結(jié)合國(guó)內(nèi)原料藥及其制劑中雜質(zhì)含量的實(shí)際情況，建立HPLC 法測(cè)定富馬酸比索洛爾及其制劑中的有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；島津LC-20AD 高效液相色譜儀（島津中國(guó)有限公司）；CPA225D 十萬(wàn)分之一電子天平、XPR6UD5 百萬(wàn)分之一電子天平、SevenExcellence 多參數(shù)測(cè)量酸度計(jì)（梅特勒-托利多公司）；Sartorius arium pro 純水儀（德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 試藥

富馬酸比索洛爾對(duì)照品（批號(hào)：100711-201602，純度：99.7%）、富馬酸對(duì)照品（批號(hào)：111541-201803，純度：99.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），雜質(zhì)A（批號(hào)：A-J20161128-01，純度：99.7%）、雜質(zhì)B（批號(hào)：LGC，MM0460.07，純度：100%）、雜質(zhì)E（批號(hào)：19085，純度：99.5%）、雜質(zhì)G（批號(hào)：1455-093A2，純度：99.2%）、雜質(zhì)K（批號(hào)：3015-0692A2，純度：99.3%）、雜質(zhì)L（批號(hào)：150401，純度：97.1%）、雜質(zhì)M（批號(hào)：VST019，純度：97.0%）、雜質(zhì)N-醛（批號(hào)：VST009，純度：97.0%）、雜質(zhì)酸（批號(hào)：VST020，純度：97.0%）、雜質(zhì)羥乙酯（批號(hào)：VST021，純度：97.0%）（自制）。磷酸二氫銨（分析純）、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）、水為純化水。

圖1 富馬酸比索洛爾及其雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure formula of bisoprolol fumarate and its impurity

富馬酸比索洛爾原料藥（企業(yè)A，批號(hào)：1712241；企業(yè)B，批號(hào)：9351059、9351060、9351061；企業(yè)C，批號(hào)：20160202、180402、181201）；富馬酸比索洛爾片（企業(yè)A，批號(hào)：1903115、1808281；企業(yè)B，批號(hào)：NT001201、NT001882；企業(yè)C，批號(hào)：200306、180802）；富馬酸比索洛爾膠囊（企業(yè)D，批號(hào)：190101、190201、190702，規(guī)格：2.5 mg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫銨3.45 g，加水900 mL，磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5，加水至1000 mL），流動(dòng)相B 為磷酸鹽緩沖液-乙腈（20∶80，V/V），梯度洗脫，流速1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)酸、雜質(zhì)L、雜質(zhì)羥乙酯、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N-醛和富馬酸比索洛爾對(duì)照品適量，用溶劑（磷酸鹽緩沖液）溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含比索洛爾1 μg、雜質(zhì)A 1.5 μg、雜質(zhì)羥乙酯和雜質(zhì)酸2 μg、其他雜質(zhì)2.5 μg 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于富馬酸比索洛爾25 mg），精密稱定，置50 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 對(duì)照溶液的制備 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，分別置于100 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液 分別稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)酸、雜質(zhì)L、雜質(zhì)羥乙酯、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N-醛和富馬酸比索洛爾對(duì)照品適量，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含比索洛爾500 μg 和其他各已知雜質(zhì)2 μg 的溶液，即得。

2.2.5 空白輔料溶液 取混合輔料約0.75 g，置50 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果空白輔料峰無(wú)干擾，比索洛爾峰與各雜質(zhì)峰分離度均＞1.5，理論板數(shù)均＞3000，見(jiàn)圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatogram of system suitability

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 取富馬酸比索洛爾原料（企業(yè)B，批號(hào)：9351060）約25 mg，加混合輔料（均為片劑與膠囊的混合輔料）0.75 g 置50 mL 量瓶中，分別按以下方式處理：

① 加水溶解稀釋至刻度，搖勻，作為未破壞供試品溶液；② 酸破壞：加入1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，室溫放置1.5 h 后，加入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL 中和，加水稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞供試品溶液；③ 堿破壞：加2 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，100℃水浴加熱3 h，加入2 mol·L－1鹽酸溶液2 mL 中和，加水稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞供試品溶液；④ 氧化破壞：加30%的過(guò)氧化氫溶液2 mL，水浴80℃加熱2 h，加水稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞供試品溶液；⑤ 高溫破壞：加水適量溶解，于100℃水浴加熱4 h，加水稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞供試品溶液；⑥ 光照破壞：置日光燈下照射48 h，取出，加水稀釋至刻度，搖勻作為強(qiáng)光破壞供試品溶液。

精密量取上述供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)比未破壞供試品溶液色譜圖，酸破壞檢出8 個(gè)雜質(zhì)，其中雜質(zhì)A 含量較高（10.18%）；堿破壞檢出9 個(gè)雜質(zhì)，其中雜質(zhì)A 含量較高（0.29%）；氧化破壞產(chǎn)生雜質(zhì)較多；高溫破壞、光照破壞未產(chǎn)生新雜質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of related substances in bisoprolol fumarate from specificity test

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取雜質(zhì)A、G、K、L、M、N-醛、羥乙酯、酸及富馬酸比索洛爾對(duì)照品各約2.5 mg，分別置10 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取各溶液適量置同一10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋制成每1 mL 中分別約含富馬酸比索洛爾15 μg、雜質(zhì)A 15 μg、雜質(zhì)G 25 μg、雜質(zhì)K 25 μg、雜質(zhì)L 25 μg、雜質(zhì)M 25 μg、雜質(zhì)N-醛 25 μg、雜質(zhì)羥乙酯20 μg、雜質(zhì)酸20 μg 的溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，取適量稀釋成限度濃度的1000%、500%、200%、100%、50%、20%的線性溶液。分別精密量取20 μL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 已知雜質(zhì)線性范圍Tab 2 Linearity of the known impurity

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下100%質(zhì)量濃度線性溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果比索洛爾及各雜質(zhì)峰面積的RSD均小于1.2%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 檢測(cè)限與定量限考察 取“2.3.3”項(xiàng)下富馬酸比索洛爾及各雜質(zhì)的對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以信噪比為3∶1，計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比為10∶1計(jì)算定量限。結(jié)果，雜質(zhì)A、G、K、L、M、N-醛、羥乙酯、酸及比索洛爾的檢測(cè)限分別為0.031、0.049、0.057、0.054、0.043、0.048、0.043、0.051、0.032 μg·mL－1，定量限分別為0.152、0.246、0.286、0.268、0.216、0.241、0.214、0.257、0.159 μg·mL－1。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下100%質(zhì)量濃度線性溶液及“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于5℃放置0、6、12、17、24 h 后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果混合對(duì)照品和供試品溶液在5℃下放置24 h 內(nèi)雜質(zhì)個(gè)數(shù)及雜質(zhì)量均無(wú)明顯變化。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取片劑細(xì)粉和膠囊劑內(nèi)容物細(xì)粉適量（本底中含0.152 μg·mg－1的雜質(zhì)A 及1.562 μg·mg－1的雜質(zhì)G），共9 份，分別置10 mL 量瓶中，分別精密量取“2.3.3”項(xiàng)下混合對(duì)照 品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，置上述量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果雜質(zhì)A 回收率在100.74%～104.86%，RSD為1.3%；雜質(zhì)G 回收率在98.15%～106.21%，RSD為2.5%；雜質(zhì)K 回收率在100.44%～105.23%，RSD為1.6%；雜質(zhì)L 回收率在104.68%～108.82%，RSD為1.2%；雜質(zhì)M回收率在100.61%～105.63%，RSD為1.5%；雜質(zhì)N-醛回收率在98.80%～103.92%，RSD為1.5%；雜質(zhì)羥乙酯回收率在100.13%～104.44%，RSD為1.3%；雜質(zhì)酸回收率在90.45%～94.42%，RSD為1.4%。

2.3.8 耐用性試驗(yàn) 分別調(diào)整各色譜參數(shù)：流速[（1.0±0.05）mL·min－1]、柱溫（35℃、40℃）、流動(dòng)相pH 值（2.5±0.1），取系統(tǒng)適用性溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，各條件下8 個(gè)已知雜質(zhì)與主峰之間的分離度均能不低于1.2，結(jié)果重現(xiàn)性較好，方法耐用性良好。

2.3.9 樣品測(cè)定 分別取各生產(chǎn)企業(yè)的原料藥或制劑樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中各雜質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果(%)Tab 3 Impurity determination in the samples(%)

3 討論

3.1 色譜條件的篩選與確定

BP2020 中收載的已知雜質(zhì)最多，故本次研究大部分雜質(zhì)沿用了BP2020[8]中的雜質(zhì)命名，雜質(zhì)酸、雜質(zhì)羥乙酯和雜質(zhì)N-醛沿用的是進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20150419[9]。收集目前標(biāo)準(zhǔn)中收載的共10 個(gè)已知雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行系統(tǒng)適用性研究，在參照目前獲批的4 個(gè)片劑最新國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（分別沿用的ChP2020 原料有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)和進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20150419 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)）和1 個(gè)原料最新藥品標(biāo)準(zhǔn)[10]的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20150419 的色譜系統(tǒng)優(yōu)化后可以在一個(gè)色譜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)10 個(gè)已知雜質(zhì)的良好分離，色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig 4 System suitability chromatogram of bisoprolol fumarate

3.2 已知雜質(zhì)的收載

對(duì)比國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)表明：BP2020 富馬酸比索洛爾原料中收載了15 個(gè)已知雜質(zhì)，明確控制了3 個(gè)已知雜質(zhì)；BP2020 片劑中收載并明確控制了6 個(gè)已知雜質(zhì)；片劑進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX2015019 中明確控制了7 個(gè)已知雜質(zhì)；片劑標(biāo)準(zhǔn)YBH06092019 及YBH07222020 中收載并明確控制了9 個(gè)已知雜質(zhì)；片劑標(biāo)準(zhǔn)YBH05892018 中收載并明確控制了3 個(gè)已知雜質(zhì)。各標(biāo)準(zhǔn)收載的已知雜質(zhì)多有交叉，且基本在BP2020 中有收載。結(jié)合本品的實(shí)際處方及生產(chǎn)工藝分析，本研究初期對(duì)有關(guān)物質(zhì)中需要重點(diǎn)控制的8個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行了研究。但由于各雜質(zhì)的特性各異，研究中未找到合適的破壞條件制備同時(shí)含多個(gè)雜質(zhì)的系統(tǒng)適用性溶液，考慮到后期標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行中各雜質(zhì)對(duì)照品的獲取問(wèn)題，在最后的擬訂標(biāo)準(zhǔn)中收載了在樣品普遍存在且最能反映樣品質(zhì)量的4 個(gè)雜質(zhì)（雜質(zhì)A、雜質(zhì)L、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K）作為已知雜質(zhì)控制，其余各雜質(zhì)均作為“其他雜質(zhì)”一并控制。

3.3 雜質(zhì)限度的擬訂

參考人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）的要求[11-12]，擬訂原料限度如下：除富馬酸及富馬酸之前的色譜峰不計(jì)外，如有與雜質(zhì)A、雜質(zhì)L、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K 保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，分別不得過(guò)0.3%、0.1%、0.1%、0.1%，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液中比索洛爾峰面積的0.1 倍（0.10%），雜質(zhì)總量不得過(guò)0.5%；擬訂制劑限度如下：除富馬酸及富馬酸之前的色譜峰不計(jì)外，如有與雜質(zhì)A、雜質(zhì)L、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K 保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，分別不得過(guò)0.3%、0.5%、0.5%、0.5%，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液中比索洛爾峰面積的0.2 倍（0.2%），雜質(zhì)總量不得過(guò)2.0%。

3.4 影響因素試驗(yàn)

參照ChP2020 四部指導(dǎo)原則＜9001＞《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》，考察3 家企業(yè)富馬酸比索洛爾片（各1 批）的雜質(zhì)變化情況。在高溫下放置10 d 后，3 家企業(yè)的雜質(zhì)總量均明顯增大（A 企業(yè)0.19%→0.71%，B 企業(yè)1.17%→2.21%，C 企業(yè)0.30%→1.15%），但已知雜質(zhì)變化情況各異（A 企業(yè)主要是雜質(zhì)L 由0.05%→0.19%，B 企業(yè)主要是雜質(zhì)K 由0.42%→1.00%，C 企業(yè)主要是雜質(zhì)L 由0.05%→0.15%）。在高濕下放置10 d 后，A 企業(yè)和C 企業(yè)樣品的雜質(zhì)總量均無(wú)明顯變化，但B 企業(yè)的雜質(zhì)總量明顯增大（1.17%→1.95%），主要是由于雜質(zhì)L 和雜質(zhì)G 的增大引起的。在光照下放置10 d 后，A 企業(yè)和C 企業(yè)樣品的雜質(zhì)總量均無(wú)明顯變化，但B 企業(yè)的雜質(zhì)總量明顯增大（1.17%→2.03%），主要是由于雜質(zhì)L、雜質(zhì)G、雜質(zhì)M 和雜質(zhì)N-醛的增大引起的。各企業(yè)樣品在影響因素試驗(yàn)中表現(xiàn)差異較大。

綜上所述，本次研究為富馬酸比索洛爾原料、片劑及膠囊提供了一個(gè)科學(xué)、合理及全面的有關(guān)物質(zhì)分析方法，可以為該品種的系統(tǒng)質(zhì)量控制提供參考。