袁蒙蒙,陰美華,唐志書,許洪波*,陳世忠(.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西 咸陽 72046;2.北京大學(xué)藥學(xué)院,北京 009)
遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志Palygala sibiricaL.的干燥根。氣微,味苦,微辛,具有安神益智、祛痰、消腫解毒的功效,臨床用于治療心腎不交引起的失眠多夢、咳痰不爽、瘡瘍腫毒等。遠志中含有多種皂苷、酮及糖酯類成分,如細葉遠志皂苷A,遠志酮Ⅲ和3,6'-二芥子?;崽堑萚1]。其中皂苷類成分可刺激胃黏膜,反射性地增加支氣管的分泌而發(fā)揮祛痰作用,但同時會導(dǎo)致輕度惡心[2-3]。
遠志最早記載于漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》,在中醫(yī)藥治療中應(yīng)用較為廣泛,其臨床主要使用生遠志、制遠志、蜜遠志等,不同炮制方法對于中藥遠志的有效成分含量和療效存在差異[4]。在《雷公炮炙論》中記載遠志可用甘草炮制,“凡使遠志,先須去心,若不去心,服之令人悶。去心了,用熟甘草湯浸一宿,漉出,曝干用之”。有研究表明遠志經(jīng)蜜炙后,其所含有的細葉遠志皂苷減少,提示遠志炮制解毒的機制可能是通過降低皂苷含量來實現(xiàn)的[5]。本研究利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化制遠志和蜜遠志的炮制工藝,同時建立了HPLC 法測定不同炮制法遠志中7 種有效成分的含量,為遠志的臨床應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)提供參考。
島津UPLC 液相色譜儀(LC-20ADXR 高壓泵、CTO-20AC 柱溫箱、SPD-M20A 二極管陣列檢測器、SIL-20AC 自動進樣器、CBM-20A 控制器、DGU-20A5R自動脫氣機、LC Solution 工作站);電子天平(ME204,瑞士Mettler-Toledo 公司);101 型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司);Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司);多功能粉碎機(TQ-500,上海天祺盛世科技有限公司);水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)。
生遠志(寶雞市博仁藥業(yè)有限公司),由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部陳世忠教授鑒定為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根。7 種對照品信息見表1。乙腈(色譜純,Merck 公司),甲酸(色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),超純水(Milli-Q 制備),甲醇(色譜純,Merck 公司)。
表1 對照品信息Tab 1 Reference material information
2.1.1 HPLC 色譜條件[6-9]色譜柱:Hypersil GOLDTM C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);流動相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);按照表2 進行梯度洗脫;檢測波長為310 nm;進樣量為3 μL;柱溫30℃;流速為0.4 mL·min-1。按照上述色譜條件測定飲片中7 種對照品的含量,分別測定對照品和樣品,記錄色譜圖。
表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution
2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入85%甲醇15 mL,稱定重量,80 ℃條件下加熱回流70 min,放冷,再稱定重量,用85%甲醇補足減失重量,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下的單一對照品儲備液,以甲醇倍比稀釋5 次,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,測定峰面積,繪制各標準曲線,得到線性回歸方程和線性范圍,結(jié)果見表3,色譜圖見圖1。
表3 7 種指標成分的回歸方程及線性范圍Tab 3 Regression equation and linearity of 7 index components
圖1 遠志樣品(A)和混合對照品(B)HPLC 圖Fig 1 High performance liquid chromatography of Polygala tenuifolia(A)and mixed reference substance(B)
2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液,按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,重復(fù)進樣6次,結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?;崽恰⒓毴~遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為1.1%、0.26%、0.49%、0.58%、0.90%、0.25%、0.15%,表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批遠志藥材粉末,按照“2.1.3”項下制備供試品溶液,室溫放置,分別在0、2、4、8、12 h,進樣測定,結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?;崽?、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為2.1%、0.66%、1.0%、2.4%、1.1%、0.66%、1.1%,表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批遠志藥材粉末6 份,精密稱定,按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?;崽?、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為1.3%、0.90%、0.81%、2.7%、2.6%、0.99%、1.2%,表明方法重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取9 份已知含量的遠志飲片粉末(過三號篩)0.5 g,每3 份分別按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2 精密加入遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F 對照品,按“2.1.3”項下方法制備,進樣測定,計算7種成分的平均加樣回收率和RSD值,遠志酮B為96.22%(RSD=1.9%)、遠志糖苷C 為94.58%(RSD=2.0%)、細葉遠志皂苷A 為102.34%(RSD=1.0%)、遠志酮Ⅲ為96.63%(RSD=0.97%)、3,6'-二芥子?;崽菫?8.75%(RSD=2.3%)、遠志皂苷B 為98.81%(RSD=1.3%)、遠志皂苷F 為103.85%(RSD=2.6%)。
采用加權(quán)平均法,根據(jù)7 種對照品成分的藥理作用情況,確定遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?;崽堑暮烤紮?quán)重的25%,細葉遠志皂苷A、遠志酮B、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F的含量均占權(quán)重的10%[10]。本試驗以綜合評分OD值(Y)為評價指標,Y=(A/Amax)×25%+(B/Bmax)×25%+(C/Cmax)×10%+(D/Dmax)×10%+(E/Emax)×10%+(F/Fmax)×10%+(G/Gmax)×10%,Amax~Gmax分別為各成分對應(yīng)的最高含量。
2.2.1 制遠志單因素炮制工藝考察 分別考察輔料甘草汁用量(4%、5%、6%、7%、8%),加水倍數(shù)(25、30、35、40、45 倍)及煎煮時間(25、30、35、40、45 min)對遠志炮制的影響。稱取甘草,純凈水浸泡,煎煮兩次,合并甘草水煎液,加入遠志采用文火煮至甘草汁吸盡[11-12]。取出冷卻,干燥,即得制遠志飲片。計算綜合評分,結(jié)果見圖2。炮制輔料用量為5%、加水倍數(shù)35 倍、煎煮時間為40 min 時,綜合評分最高,因此,將其選擇作為響應(yīng)面試驗中炮制輔料用量的中心點。
圖2 輔料用量(A)、加水倍數(shù)(B)和煎煮時間(C)對制遠志綜合評分的影響Fig 2 Influence of the amount of excipients(A),water addition(B)and decoction time(C)on the comprehensive score of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia
2.2.2 蜜遠志單因素炮制工藝考察 考察炮制輔料蜜煉的用量(15%、20%、25%、30%、35%),炮制溫度(100、120、140、160、180℃)、炮制時間(3、8、13、18、23 min)對蜜遠志炮制工藝的影響。稱遠志樣品200 g,分別燜潤2 h,用文火炒至煉蜜被吸盡,遠志表面為深黃色且不黏手,取出冷卻,干燥,即得蜜遠志飲片[13-14]。同法計算綜合評分,結(jié)果見圖3。炮制輔料用量為25%、炮制溫度為140℃、烘制時間為8 min 時,綜合評分最高,因此,將其作為響應(yīng)面試驗中炮制輔料用量的中心點。
圖3 輔料用量(D)、溫度(E)和炮制時間(F)對蜜遠志綜合評分的影響Fig 3 Influence of the amount of excipients(D),temperature(E)and processing time(F)on the comprehensive score of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia
2.3.1 試驗設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理,利用Design-Expert 8.0.6 軟件,設(shè)計3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗。選取甘草用量(A)、加水倍數(shù)(B)和煎煮時間(C)為自變量,以遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3,6'-二芥子?;崽恰⒓毴~遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F 的綜合評分(Y1)為響應(yīng)值,考察制遠志的炮制工藝;同時,在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選用煉蜜用量(D)、炮制時間(E)、炮制溫度(F)作為考察因素,綜合評分(Y2)為響應(yīng)值,考察蜜遠志的炮制工藝。利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計3 因素3 水平試驗,因素與水平見表4。試驗安排與結(jié)果見表5。
表4 制遠志及蜜遠志響應(yīng)面試驗因素與水平Tab 4 Factor and level of response surface test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia
表5 制遠志及蜜遠志響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 5 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia response surface test arrangement and results
2.3.2 回歸模型的建立及分析 對試驗結(jié)果進行擬合回歸分析,得到Y(jié)1=80.31+5.71A+1.61B+0.11C+3.90A2+1.66B2+0.21C2-1.10AB+0.36AC+0.26BC;Y2=84.86-3.64A+0.030B-2.44C-3.47A2-3.16B2-2.19C2+5.64AB-1.73AC-0.040BC。該模型P<0.001,具有極顯著性并且與數(shù)據(jù)的擬合度好,誤差低,可以用于進一步的分析與檢測[15-16],結(jié)果見表6。
表6 制遠志和蜜遠志回歸模型方差分析Tab 6 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia regression model variance analysis
2.3.3 響應(yīng)面圖的分析與優(yōu)化 根據(jù)制遠志回歸方程可繪制出響應(yīng)曲面,見圖4。由圖4可知,在響應(yīng)面試驗中時間的梯度設(shè)計較小,對制遠志的綜合評分影響較小。甘草用量與加水量的交互作用對Y1的影響較大,所以圖中顯示曲面較為陡峭;加水量越大制遠志提取液中有效成分的含量更高,但從節(jié)約能源和生產(chǎn)耗能方面考慮,加水量應(yīng)根據(jù)試驗調(diào)整。甘草用量為5.96%,加水量為36.21 倍,時間設(shè)定為40.43 min 時為制遠志的最佳炮制工藝。
圖4 不同炮制參數(shù)對制遠志綜合評分Y1 的響應(yīng)面圖Fig 4 Response surface plot of different processing parameters to the comprehensive score Y1 of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia
根據(jù)蜜遠志回歸方程可繪制響應(yīng)曲面,見圖5。由圖5可知,在煉蜜用量與溫度交互作用時曲面較為陡峭,分析原因可能是由于溫度會使煉蜜性質(zhì)發(fā)生變化,從而影響蜜遠志的成分的含量,所以對蜜遠志的綜合評分Y2影響較大。在煉蜜用量為25%,溫度為122.27 ℃,時間設(shè)定為7.22 min 時可以得到蜜遠志的最佳炮制工藝。
圖5 不同炮制參數(shù)對蜜遠志綜合評分Y2 的響應(yīng)面圖Fig 5 Response surface diagram of different processing parameters to the comprehensive score Y2 of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia
以遠志為原料,根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測值和實際操作調(diào)整制遠志的炮制工藝為甘草用量6%,加水36倍,炮制時間為40 min;蜜遠志的炮制工藝為煉蜜用量25%,溫度123℃,炮制時間為7 min。按上述最優(yōu)制備工藝進行驗證,平行操作6 次,測定7 種成分的含量,結(jié)果見表7。所得制遠志綜合評分(90.08%)與預(yù)測值89.69%相近,蜜遠志綜合評分(85.45%)與預(yù)測值87.58%相近,這說明該工藝條件穩(wěn)定可行,模型擬合效果良好[17]。
表7 制遠志和蜜遠志的驗證試驗結(jié)果(%)Tab 7 Verification test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia (%)
本研究利用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化了制遠志和蜜遠志的炮制工藝,篩選甘草的用量、加水倍量和煎煮時間以及煉蜜用量、溫度和炮制時間對遠志炮制工藝過程具有顯著性影響的因素,對試驗數(shù)據(jù)建立二次多項式回歸模型,明確了最優(yōu)工藝。
在中藥的炮制過程中輔料的用量和炮制時參數(shù)的設(shè)定對與中藥有效成分含量有較大影響,由試驗結(jié)果知,制遠志含量的綜合評分較蜜遠志高,蜜炙后所含遠志皂苷減少,減毒效果更好。甘草制遠志時甘草用量和加水量的變化對綜合評分影響較大;煉蜜炮制遠志時煉蜜的用量和炮制溫度對蜜遠志的質(zhì)量影響較大,在試驗和生產(chǎn)中需要對其參數(shù)進行量化考察,依據(jù)文獻報道和響應(yīng)面試驗因素之間的交互作用結(jié)果得到最佳工藝參數(shù),制遠志的最佳炮制工藝為甘草用量6%,加水36 倍,炮制時間為40 min;蜜遠志的最佳炮制工藝為煉蜜用量25%,溫度123℃,炮制時間為7 min。通過試驗設(shè)計和驗證能夠在一定程度上控制炮制遠志的質(zhì)量,提高工藝的穩(wěn)定性,為中藥遠志的炮制工藝優(yōu)化提供參考。