袁蒙蒙，陰美華，唐志書，許洪波*，陳世忠（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 72046；2.北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 009）

遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志Palygala sibiricaL.的干燥根。氣微，味苦，微辛，具有安神益智、祛痰、消腫解毒的功效，臨床用于治療心腎不交引起的失眠多夢、咳痰不爽、瘡瘍腫毒等。遠志中含有多種皂苷、酮及糖酯類成分，如細葉遠志皂苷A，遠志酮Ⅲ和3，6'-二芥子?；崽堑萚1]。其中皂苷類成分可刺激胃黏膜，反射性地增加支氣管的分泌而發(fā)揮祛痰作用，但同時會導(dǎo)致輕度惡心[2-3]。

遠志最早記載于漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，在中醫(yī)藥治療中應(yīng)用較為廣泛，其臨床主要使用生遠志、制遠志、蜜遠志等，不同炮制方法對于中藥遠志的有效成分含量和療效存在差異[4]。在《雷公炮炙論》中記載遠志可用甘草炮制，“凡使遠志，先須去心，若不去心，服之令人悶。去心了，用熟甘草湯浸一宿，漉出，曝干用之”。有研究表明遠志經(jīng)蜜炙后，其所含有的細葉遠志皂苷減少，提示遠志炮制解毒的機制可能是通過降低皂苷含量來實現(xiàn)的[5]。本研究利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化制遠志和蜜遠志的炮制工藝，同時建立了HPLC 法測定不同炮制法遠志中7 種有效成分的含量，為遠志的臨床應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津UPLC 液相色譜儀（LC-20ADXR 高壓泵、CTO-20AC 柱溫箱、SPD-M20A 二極管陣列檢測器、SIL-20AC 自動進樣器、CBM-20A 控制器、DGU-20A5R自動脫氣機、LC Solution 工作站）；電子天平（ME204，瑞士Mettler-Toledo 公司）；101 型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；多功能粉碎機（TQ-500，上海天祺盛世科技有限公司）；水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

生遠志（寶雞市博仁藥業(yè)有限公司），由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部陳世忠教授鑒定為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根。7 種對照品信息見表1。乙腈（色譜純，Merck 公司），甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），超純水（Milli-Q 制備），甲醇（色譜純，Merck 公司）。

表1 對照品信息Tab 1 Reference material information

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 HPLC 色譜條件[6-9]色譜柱：Hypersil GOLDTM C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；按照表2 進行梯度洗脫；檢測波長為310 nm；進樣量為3 μL；柱溫30℃；流速為0.4 mL·min－1。按照上述色譜條件測定飲片中7 種對照品的含量，分別測定對照品和樣品，記錄色譜圖。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入85%甲醇15 mL，稱定重量，80 ℃條件下加熱回流70 min，放冷，再稱定重量，用85%甲醇補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下的單一對照品儲備液，以甲醇倍比稀釋5 次，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，繪制各標準曲線，得到線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表3，色譜圖見圖1。

表3 7 種指標成分的回歸方程及線性范圍Tab 3 Regression equation and linearity of 7 index components

圖1 遠志樣品（A）和混合對照品（B）HPLC 圖Fig 1 High performance liquid chromatography of Polygala tenuifolia（A）and mixed reference substance（B）

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)進樣6次，結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽恰⒓毴~遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為1.1%、0.26%、0.49%、0.58%、0.90%、0.25%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批遠志藥材粉末，按照“2.1.3”項下制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12 h，進樣測定，結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為2.1%、0.66%、1.0%、2.4%、1.1%、0.66%、1.1%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批遠志藥材粉末6 份，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷FRSD分別為1.3%、0.90%、0.81%、2.7%、2.6%、0.99%、1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取9 份已知含量的遠志飲片粉末（過三號篩）0.5 g，每3 份分別按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2 精密加入遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子酰基蔗糖、細葉遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F 對照品，按“2.1.3”項下方法制備，進樣測定，計算7種成分的平均加樣回收率和RSD值，遠志酮B為96.22%（RSD＝1.9%）、遠志糖苷C 為94.58%（RSD＝2.0%）、細葉遠志皂苷A 為102.34%（RSD＝1.0%）、遠志酮Ⅲ為96.63%（RSD＝0.97%）、3，6'-二芥子?；崽菫?8.75%（RSD＝2.3%）、遠志皂苷B 為98.81%（RSD＝1.3%）、遠志皂苷F 為103.85%（RSD＝2.6%）。

2.2 評價方法

采用加權(quán)平均法，根據(jù)7 種對照品成分的藥理作用情況，確定遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽堑暮烤紮?quán)重的25%，細葉遠志皂苷A、遠志酮B、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F的含量均占權(quán)重的10%[10]。本試驗以綜合評分OD值（Y）為評價指標，Y＝（A/Amax）×25%＋（B/Bmax）×25%＋（C/Cmax）×10%＋（D/Dmax）×10%＋（E/Emax）×10%＋（F/Fmax）×10%＋（G/Gmax）×10%，Amax～Gmax分別為各成分對應(yīng)的最高含量。

2.2.1 制遠志單因素炮制工藝考察 分別考察輔料甘草汁用量（4%、5%、6%、7%、8%），加水倍數(shù)（25、30、35、40、45 倍）及煎煮時間（25、30、35、40、45 min）對遠志炮制的影響。稱取甘草，純凈水浸泡，煎煮兩次，合并甘草水煎液，加入遠志采用文火煮至甘草汁吸盡[11-12]。取出冷卻，干燥，即得制遠志飲片。計算綜合評分，結(jié)果見圖2。炮制輔料用量為5%、加水倍數(shù)35 倍、煎煮時間為40 min 時，綜合評分最高，因此，將其選擇作為響應(yīng)面試驗中炮制輔料用量的中心點。

圖2 輔料用量（A）、加水倍數(shù)（B）和煎煮時間（C）對制遠志綜合評分的影響Fig 2 Influence of the amount of excipients（A），water addition（B）and decoction time（C）on the comprehensive score of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

2.2.2 蜜遠志單因素炮制工藝考察 考察炮制輔料蜜煉的用量（15%、20%、25%、30%、35%），炮制溫度（100、120、140、160、180℃）、炮制時間（3、8、13、18、23 min）對蜜遠志炮制工藝的影響。稱遠志樣品200 g，分別燜潤2 h，用文火炒至煉蜜被吸盡，遠志表面為深黃色且不黏手，取出冷卻，干燥，即得蜜遠志飲片[13-14]。同法計算綜合評分，結(jié)果見圖3。炮制輔料用量為25%、炮制溫度為140℃、烘制時間為8 min 時，綜合評分最高，因此，將其作為響應(yīng)面試驗中炮制輔料用量的中心點。

圖3 輔料用量（D）、溫度（E）和炮制時間（F）對蜜遠志綜合評分的影響Fig 3 Influence of the amount of excipients（D），temperature（E）and processing time（F）on the comprehensive score of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.3 制遠志及蜜遠志響應(yīng)面法優(yōu)化炮制工藝

2.3.1 試驗設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，利用Design-Expert 8.0.6 軟件，設(shè)計3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗。選取甘草用量（A）、加水倍數(shù)（B）和煎煮時間（C）為自變量，以遠志酮B、遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽恰⒓毴~遠志皂苷A、遠志糖苷C、遠志皂苷B、遠志皂苷F 的綜合評分（Y1）為響應(yīng)值，考察制遠志的炮制工藝；同時，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用煉蜜用量（D）、炮制時間（E）、炮制溫度（F）作為考察因素，綜合評分（Y2）為響應(yīng)值，考察蜜遠志的炮制工藝。利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計3 因素3 水平試驗，因素與水平見表4。試驗安排與結(jié)果見表5。

表4 制遠志及蜜遠志響應(yīng)面試驗因素與水平Tab 4 Factor and level of response surface test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

表5 制遠志及蜜遠志響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 5 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia response surface test arrangement and results

2.3.2 回歸模型的建立及分析 對試驗結(jié)果進行擬合回歸分析，得到Y(jié)1＝80.31＋5.71A＋1.61B＋0.11C＋3.90A2＋1.66B2＋0.21C2－1.10AB＋0.36AC＋0.26BC；Y2＝84.86－3.64A＋0.030B－2.44C－3.47A2－3.16B2－2.19C2＋5.64AB－1.73AC－0.040BC。該模型P＜0.001，具有極顯著性并且與數(shù)據(jù)的擬合度好，誤差低，可以用于進一步的分析與檢測[15-16]，結(jié)果見表6。

表6 制遠志和蜜遠志回歸模型方差分析Tab 6 Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia regression model variance analysis

2.3.3 響應(yīng)面圖的分析與優(yōu)化 根據(jù)制遠志回歸方程可繪制出響應(yīng)曲面，見圖4。由圖4可知，在響應(yīng)面試驗中時間的梯度設(shè)計較小，對制遠志的綜合評分影響較小。甘草用量與加水量的交互作用對Y1的影響較大，所以圖中顯示曲面較為陡峭；加水量越大制遠志提取液中有效成分的含量更高，但從節(jié)約能源和生產(chǎn)耗能方面考慮，加水量應(yīng)根據(jù)試驗調(diào)整。甘草用量為5.96%，加水量為36.21 倍，時間設(shè)定為40.43 min 時為制遠志的最佳炮制工藝。

圖4 不同炮制參數(shù)對制遠志綜合評分Y1 的響應(yīng)面圖Fig 4 Response surface plot of different processing parameters to the comprehensive score Y1 of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia

根據(jù)蜜遠志回歸方程可繪制響應(yīng)曲面，見圖5。由圖5可知，在煉蜜用量與溫度交互作用時曲面較為陡峭，分析原因可能是由于溫度會使煉蜜性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響蜜遠志的成分的含量，所以對蜜遠志的綜合評分Y2影響較大。在煉蜜用量為25%，溫度為122.27 ℃，時間設(shè)定為7.22 min 時可以得到蜜遠志的最佳炮制工藝。

圖5 不同炮制參數(shù)對蜜遠志綜合評分Y2 的響應(yīng)面圖Fig 5 Response surface diagram of different processing parameters to the comprehensive score Y2 of Honey-stir-baked Polygala tenuifolia

2.6 驗證試驗

以遠志為原料，根據(jù)響應(yīng)面預(yù)測值和實際操作調(diào)整制遠志的炮制工藝為甘草用量6%，加水36倍，炮制時間為40 min；蜜遠志的炮制工藝為煉蜜用量25%，溫度123℃，炮制時間為7 min。按上述最優(yōu)制備工藝進行驗證，平行操作6 次，測定7 種成分的含量，結(jié)果見表7。所得制遠志綜合評分（90.08%）與預(yù)測值89.69%相近，蜜遠志綜合評分（85.45%）與預(yù)測值87.58%相近，這說明該工藝條件穩(wěn)定可行，模型擬合效果良好[17]。

表7 制遠志和蜜遠志的驗證試驗結(jié)果(%)Tab 7 Verification test of Glycyrrhiza Polygala tenuifolia and Honey-stir-baked Polygala tenuifolia (%)

3 討論

本研究利用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化了制遠志和蜜遠志的炮制工藝，篩選甘草的用量、加水倍量和煎煮時間以及煉蜜用量、溫度和炮制時間對遠志炮制工藝過程具有顯著性影響的因素，對試驗數(shù)據(jù)建立二次多項式回歸模型，明確了最優(yōu)工藝。

在中藥的炮制過程中輔料的用量和炮制時參數(shù)的設(shè)定對與中藥有效成分含量有較大影響，由試驗結(jié)果知，制遠志含量的綜合評分較蜜遠志高，蜜炙后所含遠志皂苷減少，減毒效果更好。甘草制遠志時甘草用量和加水量的變化對綜合評分影響較大；煉蜜炮制遠志時煉蜜的用量和炮制溫度對蜜遠志的質(zhì)量影響較大，在試驗和生產(chǎn)中需要對其參數(shù)進行量化考察，依據(jù)文獻報道和響應(yīng)面試驗因素之間的交互作用結(jié)果得到最佳工藝參數(shù)，制遠志的最佳炮制工藝為甘草用量6%，加水36 倍，炮制時間為40 min；蜜遠志的最佳炮制工藝為煉蜜用量25%，溫度123℃，炮制時間為7 min。通過試驗設(shè)計和驗證能夠在一定程度上控制炮制遠志的質(zhì)量，提高工藝的穩(wěn)定性，為中藥遠志的炮制工藝優(yōu)化提供參考。