徐佳璐,顧艷麗,劉佳,呂曉潔,李瑞娟(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特 010110)
PF-3758309(PF-309)是一種以吡唑?yàn)槟负诉x擇性作用于p21 活化激酶(p21-activated kinases,PAKs)的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑,可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合PAKs 的ATP 位點(diǎn),阻斷信號(hào)傳導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而發(fā)揮靶向作用[1]。PF-309在臨床研究中用于晚期轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的治療,對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出廣泛的抑制作用[2],但PF-309 口服生物利用度較低,水溶性不高以及藥物穩(wěn)定性較差等特點(diǎn)限制了其臨床藥效[3]。脂質(zhì)體是新型的納米藥物遞送系統(tǒng),以卵磷脂為主要膜材,脂質(zhì)雙分子層與生物膜成分相似,組織相容性良好,脂質(zhì)體包載下不僅能提高難溶藥物的溶解度,增強(qiáng)藥物的治療效果,還能提高藥物的生物相容性,從而減少給藥劑量,降低藥物的毒副作用[4-5]。利用脂質(zhì)體的包埋技術(shù)使得藥物的釋放具有一定的緩釋作用,可以提高被包埋藥物的穩(wěn)定性,適合靜脈注射使用。脂質(zhì)體作為藥物載體具有淋巴趨向性,抗癌藥物包封于脂質(zhì)體中,能使藥物選擇性地殺傷癌細(xì)胞,增加藥物對(duì)淋巴的定向性,改變藥物在組織中的分布。本課題制備PF-309 脂質(zhì)體(Lip@PF-309),并以包封率為考察指標(biāo),通過正交實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)制備工藝條件并對(duì)其進(jìn)行體外質(zhì)量評(píng)價(jià),為PF-309 新劑型研究提供參考。
1260 vialsampler 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);ZD-85 雙功能氣浴恒溫振蕩器(常州金壇良友儀器有限公司);S2-100V2 型納米粒度分析儀(HORIBA日本公司);SB25-12 DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);N-1300D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社);S4800 掃描電鏡(國(guó)儀量子公司);BFX5-320 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(白洋離心機(jī)廠);UpHW-II-90T 超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司);TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);FDU-2110型冷凍干燥機(jī)(上海愛朗儀器有限公司);VOS-310C 真空定溫干燥箱(東京理化器械株式會(huì)社);Thermo Heraeus Pico 17R 冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)。
PF-309(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.20%,批號(hào):AK474043,安耐吉化學(xué));大豆卵磷脂、膽固醇(羅恩試劑有限公司);水為超純水;甲醇、三乙胺為色譜純;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡聚糖凝膠G-50(北京偶合科技有限公司);D-(+)葡萄糖(分析純,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);蔗糖(分析純,天津市科盟化工工貿(mào)有限公司);甘露醇(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乳糖(分析純,上海麥克林生化科技有限公司)。
采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體。按處方量精密稱定PF-309 2.5 mg、膽固醇12.5 mg、大豆卵磷脂25 mg,溶于5 mL 無(wú)水乙醇-三氯甲烷(3∶7)混合有機(jī)溶劑中,超聲使藥物與膜材完全溶解,45 ℃水浴條件下常壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min 后緩慢減壓至0.1 MPa,至有機(jī)溶劑完全蒸出,在蒸發(fā)得到的均勻類脂膜中加入5 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS),60 ℃水浴條件下水合1.5 h,使膜完全脫落得到脂質(zhì)體混懸液,冰水浴中超聲均化20 min,至均一體系,再經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾10 次整粒,即得Lip@PF-309,4℃下保存。
2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Hypersll GOLD C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%三乙胺水溶液(70∶30);流速為1.0 mL·min-1;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫為28℃。結(jié)果表明,在此色譜條件下,PF-309 游離藥物與空白脂質(zhì)體分離性良好,輔料對(duì)藥物的測(cè)定無(wú)干擾。
2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將質(zhì)量濃度為100μg·mL-1的PF-309 對(duì)照品溶液稀釋為5、10、20、30、40、50 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=13.26X+1.187,r=1.000,表 明PF-309在5~50 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證 制備含空白脂質(zhì)體的低、中、高3 種不同質(zhì)量濃度PF-309 樣品溶液,計(jì)算平均回收率分別為99.8%、100.0%、100.1%(n=3),RSD均小于2%,結(jié)果符合加樣回收率要求。精密吸取質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的PF-309 對(duì)照品溶液在同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5 針,記錄峰面積,計(jì)算日內(nèi)RSD;用同一個(gè)對(duì)照品溶液每日進(jìn)樣1針,連續(xù)進(jìn)樣5 d,記錄峰面積,計(jì)算日間RSD,結(jié)果日間、日內(nèi)RSD分別為0.71%、0.26%(n=5),表明精密度良好。精密取同一樣品5 份,測(cè)定,測(cè)得藥物峰面積RSD為0.45%(n=5),表明該方法重復(fù)性良好。
2.2.4 包封率的測(cè)定 采用葡聚糖微型凝膠柱離心法來分離脂質(zhì)體與游離未包封藥物[6-7]。取Lip@PF-309 混懸液0.5 mL 于10 mL 量瓶中,甲醇破乳并稀釋定容,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)總的藥物含量(W0)。另取Lip@PF-309 混懸液0.5 mL 緩慢滴加到微柱頂端,2500 r·min-1離心2.5 min 后,收集洗脫液,然后補(bǔ)充0.5 mL PBS(pH 7.2)于微柱頂端,同樣條件洗脫,連續(xù)洗脫3 次,收集所有洗脫液于10 mL 量瓶中,甲醇破乳并稀釋定容,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)包封藥物含量(W1)。根據(jù)公式計(jì)算包封率,包封率(EE%)=(W1/W0)×100%。
2.3.1 卵磷脂濃度對(duì)包封率的影響 固定其他條件不變,選取卵磷脂質(zhì)量濃度1、3、5、9、15 mg·mL-1,測(cè)定其包封率分別為79.8%、82.3%、85.2%、77.6%、75.9%,結(jié)果表明在一定范圍內(nèi),藥物的包封率隨卵磷脂濃度的增加而增加,但過高的磷脂濃度會(huì)導(dǎo)致磷脂聚集,使藥物難以釋放[8],故選擇卵磷脂濃度1、3、5 mg·mL-1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
2.3.2 膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比(膜材比)對(duì)包封率的影響 膽固醇對(duì)脂質(zhì)體膜流動(dòng)性起調(diào)節(jié)作用,改善了藥物的包封率與穩(wěn)定性,但過量的膽固醇會(huì)與脂溶性藥物(PF-309)在磷脂雙層膜中發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)置換現(xiàn)象,導(dǎo)致包封率降低。固定其他條件不變,膜材比取1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,測(cè)定其包封率分別為81.2%、85.3%、83.6%、79.5%、76.8%,故選擇膜材比為1∶1、1∶2、1∶3進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
2.3.3 藥脂比對(duì)包封率的影響 固定其他條件不變,藥脂比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30,測(cè)定其包封率分別為84.2%、88.7%、86.3%、75.5%、73.2%。結(jié)果表明,藥物的包封率隨膽固醇質(zhì)量增加而增加,當(dāng)兩者比例逐漸增大時(shí),包封率有所下降,當(dāng)藥脂比達(dá)到1∶20 時(shí),包封率較低,故選擇藥脂比為1∶5、1∶10、1∶15進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇膜材比(A)、藥脂比(B)、卵磷脂濃度(C)為考察因素,D列為誤差列,采用L9(34)因素水平表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選制備PF-309 脂質(zhì)體的最佳工藝。正交因素與水平設(shè)計(jì)見表1,以包封率為考察指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2,方差分析見表3。根據(jù)表中極值(R)直觀分析可知,影響Lip@PF-309 脂質(zhì)體包封率的因素由大到小依次為B>A>C,最佳處方為B2A2C1,即卵磷脂濃度5 mg·mL-1,膜材比1∶2,藥脂比1∶10。
表1 正交因素設(shè)計(jì)水平Tab 1 Factor and level of orthogonal design
表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab 2 Orthogonal design
表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance
按“2.4”項(xiàng)下的最優(yōu)處方,制備3 批Lip@PF-309,測(cè)得包封率分別為(92.15±0.21)%、(91.89±0.18)%、(92.22±0.06)%,表示最優(yōu)工藝有良好的重現(xiàn)性。制得的脂質(zhì)體外觀呈乳白色混懸液,平均粒徑為(112.25±0.08)nm,粒徑的多分散指數(shù)(PDI)為(0.158±0.03)(見圖1),Zeta 電位為(-7.75±0.13)mV。制得的Lip@PF-309 呈球形或類球形,粒徑集中在110~130 nm,分布較為均勻(見圖2)。4℃條件下放置30 d,Lip@PF-309沒有出現(xiàn)沉降現(xiàn)象,包封率無(wú)明顯降低,表明穩(wěn)定性良好。
圖1 Lip@PF-309 的粒徑分布圖Fig 1 Particle size of PF-309 liposome
圖2 Lip@PF-309 脂質(zhì)體掃描電鏡圖Fig 2 Scanning electronic microphotograph of PF-309 liposome
取Lip@PF-309 混懸液,以等濃度的PF-309原溶液作對(duì)照,分別吸取1 mL 移入已處理好的透析袋(8000~14 000 D)中,置于50 mL(pH 7.2)PBS 緩沖液中,于恒溫(37±1)℃、恒速(85 r·min-1)的搖床中混勻,在0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 不同時(shí)段取釋放液1 mL,HPLC 測(cè)定含量,計(jì)算平均累積釋放百分率,釋放曲線結(jié)果見圖3。PF-309 原料藥組6 h 時(shí)PF-309 累積釋放率達(dá)85.65%,釋放迅速。Lip@PF-309 組24 h 時(shí)PF-309 累計(jì)釋放率僅為 85.03%,釋放相對(duì)于原料藥組較為緩慢,參比制劑(Rt)PF-309 溶液與受試制劑(Tt)Lip@PF-309 兩者溶出曲線的相似因子(f2)值為41,小于50,說明兩者溶出曲線不相似,即緩釋效果較為明顯。
圖3 體外釋放曲線Fig 3 Drug release in vitro
分散在水溶液中的脂質(zhì)體在長(zhǎng)期貯存后一般會(huì)出現(xiàn)物理化學(xué)不穩(wěn)定性,磷脂的水解氧化和脂質(zhì)體的聚集是脂質(zhì)體不穩(wěn)定的主要原因[9]。為了提高Lip@PF-309 的儲(chǔ)備穩(wěn)定性,解決液態(tài)脂質(zhì)體無(wú)法長(zhǎng)期貯存的問題,本研究采用真空冷凍干燥技術(shù)來制備Lip@PF-309 凍干脂質(zhì)體,但是脂質(zhì)體在凍干的過程中,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)體破裂導(dǎo)致包封藥物滲漏以及粒子融合造成粒徑增大的問題,因此在冷凍干燥過程中需加入凍干保護(hù)劑。多元醇類和糖類由于結(jié)構(gòu)中均有羥基基團(tuán),均能產(chǎn)生“優(yōu)先水化作用”,可在脂質(zhì)體樣品凍干過程中起保護(hù)作用。但由于采用單個(gè)凍干保護(hù)劑凍干時(shí),凍干脂質(zhì)體的外觀欠佳,再分散性較差,包封率與凍干前脂質(zhì)體樣品差距較大等問題[10-11],故本研究將采用雙凍干保護(hù)劑聯(lián)用,來考察凍干脂質(zhì)體的最佳工藝。
2.7.1 聯(lián)用凍干保護(hù)劑種類的篩選 固定凍干保護(hù)劑加入總量為10%(w/v),兩種保護(hù)劑質(zhì)量比相等,以凍干制品的外觀、再分散性、包封率等為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察保護(hù)效果較好的甘露醇與乳糖、蔗糖和葡萄糖分別聯(lián)用對(duì)凍干樣品的保護(hù)效果。參考文獻(xiàn)[12],本研究固定預(yù)凍時(shí)間為-80℃,在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,冷凍干燥的溫度設(shè)置為-80℃,時(shí)間24 h。結(jié)果顯示甘露醇與蔗糖和葡萄糖分別聯(lián)用時(shí),得到的凍干品外觀均有萎縮且再分散性較差,而甘露醇與乳糖聯(lián)用時(shí)得到的凍干脂質(zhì)體外觀疏松飽滿,再分散性良好,復(fù)溶后的包封率接近凍干前樣品,且粒徑無(wú)明顯變化。
2.7.2 聯(lián)用凍干保護(hù)劑用量的考察 使用甘露醇-乳糖(1∶1)作為聯(lián)用保護(hù)劑,考察保護(hù)劑的總量分別為1%、5%、10%、15%、20%時(shí)對(duì)凍干脂質(zhì)體的保護(hù)作用,結(jié)果顯示,當(dāng)保護(hù)劑總量為10%時(shí),凍干品的包封率最高。
綜上所述,取2 mL Lip@PF-309 混懸液,外加10%(w/v)甘露醇-乳糖(1∶1),-80℃條件下預(yù)凍24 h,冷凍干燥過程-80℃條件下進(jìn)行24 h,制得Lip@PF-309 凍干脂質(zhì)體。外觀如圖4所示,凍干品外觀疏松平整,為白色粉末狀,高度無(wú)明顯塌陷。凍干脂質(zhì)體的再分散性良好,加入與凍干前脂質(zhì)體樣品相同體積的PBS 溶液,振搖后,凍干品即可復(fù)溶。凍干前樣品粒徑和包封率分別為112.25 nm 和92.11%,凍干后樣品的粒徑和包封率分別為115.77 nm 和90.35%,可見凍干后脂質(zhì)體的粒徑略有增大,包封率略有減小,但均無(wú)明顯的變化趨勢(shì)。
圖4 Lip@PF-309 混懸液(A)及其凍干品(B)Fig 4 Lip@PF-309 suspension(A)and freeze-dried product(B)
2.8.1 體外溶血實(shí)驗(yàn) 取新鮮鼠血,收集于肝素鈉采血管中。3000 r·min-1離心5 min,棄去上層血漿,加入約10 倍量生理鹽水搖勻后,4℃、2500 r·min-1離心10 min,棄去上層清液洗滌2~3 次,直至上清液不再呈紅色為止。吸取底層紅細(xì)胞0.8 mL,用生理鹽水稀釋至40 mL,搖勻,即得2%紅細(xì)胞混懸液[13]。取8 只潔凈離心管,編號(hào)依次為A1、A2、A3、B1、B2、B3、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。A1、A2、A3分別為10、20、40 μg·mL-1的PF-309 對(duì)照品溶液;B1、B2、B3分別為PF-309 質(zhì)量濃度為10、20、40 μg·mL-1的脂質(zhì)體混懸液;陰性對(duì)照為生理鹽水;陽(yáng)性對(duì)照為蒸餾水。每管加入適量的2%紅細(xì)胞混懸液,立即置于(37±0.5)℃的恒溫水浴中孵育30 min,離心取上清液,在535 nm 處測(cè)定吸光度(A值),計(jì)算溶血率。溶血率(%)=(Ai-A0)/(A1-A0)×100%,Ai為各供試品的吸光度,A0為陰性對(duì)照吸光度,A1為陽(yáng)性對(duì)照吸光度,溶血率>5%則表明發(fā)生溶血。結(jié)果見表4,當(dāng)PF-309 對(duì)照品達(dá)到20 μg·mL-1時(shí)的溶血率>90%,而將PF-309 包裹在脂質(zhì)體中,當(dāng)PF-309高達(dá)400 μg·mL-1時(shí),也未出現(xiàn)溶血(溶血率僅為1.88%),表明脂質(zhì)體的包裹可有效解決PF-309 溶血的不良反應(yīng)。
表4 PF-309 溶液及PF-309 脂質(zhì)體的體外溶血活性Tab 4 In vitro hemdytic activity of PF-309 solution and PF-309 liposome
2.8.2 血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 脂質(zhì)體在血液中穩(wěn)定是發(fā)揮藥物遞送作用的關(guān)鍵,從體循環(huán)向各組織器官或者體液轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中,穩(wěn)定的脂質(zhì)體形態(tài)有助于藥物更好地發(fā)揮藥效[14-15]。取新鮮鼠血置于肝素鈉采血管中,迅速于4000 r·min-1低溫離心10 min,取上層血漿待用[16]。精密吸取空白血漿450 μL 于離心管中,加入藥物質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的Lip@PF-309 混懸液50 μL(重復(fù)5 份),渦旋混勻1 min,得20 μg·mL-1的樣品液,37 ℃水浴條件下分別放置0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 后取樣。取血漿樣品200 μL 加入離心管,渦旋30 s,加乙酸乙酯3 mL,渦旋,于3000 r·min-1離心10 min,吸取上清液于另一試管中,37℃真空干燥后,加流動(dòng)相100 μL 復(fù)溶,渦旋,離心,用0.22 μm 的有機(jī)濾膜過濾后,采用HPLC 方法檢測(cè),記錄色譜圖,計(jì)算包封率。結(jié)果見表5。
表5 不同時(shí)間點(diǎn)Lip@PF-309 在血漿中的包封率及粒徑變化Tab 5 Encapsulation efficiency and particle size change of Lip@PF-309 in the plasma at different time points
由表5結(jié)果可知,Lip@PF-309 在血漿中包封率下降的速度較慢,至6 h 時(shí)Lip@PF-309 的包封率仍大于60%,這表明Lip@PF-309 注射入血后能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保持脂質(zhì)體形態(tài)完整,穩(wěn)定的劑型結(jié)構(gòu)可以使藥物在遞送系統(tǒng)的包載下,更好地到達(dá)靶部位發(fā)揮作用。
本研究旨在構(gòu)建Lip@PF-309 遞藥系統(tǒng),利用脂質(zhì)體的包埋技術(shù),來提高藥物的溶解性、穩(wěn)定性及生物相容性,改善藥物的溶血作用,并對(duì)其進(jìn)行體外質(zhì)量評(píng)價(jià)。在實(shí)體瘤生長(zhǎng)部位,病變導(dǎo)致毛細(xì)血管的通透性增加,適當(dāng)粒徑范圍的脂質(zhì)體,在病變部位的滲透性和滯留量增加。粒徑作為影響納米載藥系統(tǒng)藥動(dòng)學(xué)與藥物靶向性的主要因素,決定著脂質(zhì)體在體內(nèi)的分布與被動(dòng)靶向性作用[17]。掃描電鏡下觀察Lip@PF-309 外觀圓整、粒徑均一,粒徑<200 nm,與納米粒度儀測(cè)試結(jié)果一致,符合靜脈給藥的要求。體外釋放實(shí)驗(yàn)可知,Lip@PF-309 脂質(zhì)體混懸液相比PF-309溶液,表現(xiàn)出了較好的緩釋效果。首先可能是脂質(zhì)體作為藥物的儲(chǔ)存形式,能使包埋的內(nèi)含物緩慢釋放;其次陰離子脂質(zhì)體表面的負(fù)電荷與帶正電荷的藥物分子產(chǎn)生靜電吸附作用,提高了藥物的包封效率,達(dá)到緩釋的作用效果[18];除此之外脂質(zhì)體表面電荷的性質(zhì)會(huì)影響納米粒子的穩(wěn)定性、生物分布以及細(xì)胞親和力,Lip@PF-309 表面帶有少量的負(fù)電荷,較中性粒子可以更快更大程度地通過內(nèi)吞促進(jìn)細(xì)胞攝取,同時(shí)少量的負(fù)電荷可以降低粒子的聚集性,避免吞噬機(jī)制,從而延長(zhǎng)脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間[19]。具有苯環(huán)或共軛結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用,藥物作用于紅細(xì)胞膜的乙酰膽堿酯酶,使其受到高度抑制,使紅細(xì)胞破壞加速造成溶血[20]。經(jīng)體外溶血實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PF-309 溶液具有顯著的溶血現(xiàn)象,這也是PF-309 在臨床中引起毒副反應(yīng)的主要原因之一,本文制備的Lip@PF-309,當(dāng)脂質(zhì)體中藥物質(zhì)量濃度高達(dá)400 μg·mL-1時(shí),溶血率僅為1.88%,表明脂質(zhì)體的包裹可有效解決PF-309 引發(fā)的溶血不良反應(yīng),這為新劑型的安全性提供了參考。
本研究采用薄膜分散法制備Lip@PF-309,制備工藝簡(jiǎn)單,且制得的脂質(zhì)體納米粒有較高的包封率和良好的體外緩釋效果,顯著降低了PF-309 的溶血作用,脂質(zhì)體在血液中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,在進(jìn)入血循環(huán)到達(dá)靶部位之前,完整的形態(tài)有助于藥物更好地發(fā)揮藥效,這為L(zhǎng)ip@PF-309 的后續(xù)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及藥效研究奠定了重要基礎(chǔ),對(duì)PF-309 藥物新劑型的研發(fā)具有一定的參考價(jià)值。