吳小瑜，龍苗苗，毛靜，程沁園，邱立朋*，陳敬華（.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 4；.無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校藥學(xué)系，江蘇 無(wú)錫 408）

癌癥作為世界三大疾病之一，其新發(fā)病例與死亡人數(shù)正逐年遞增。與其他國(guó)家相比，我國(guó)癌癥治療現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，發(fā)病率和致死率均居于第一位[1]。多年來(lái)，癌癥的治療受到廣泛關(guān)注，化療作為其治療的重要策略，不良反應(yīng)嚴(yán)重、缺乏選擇性、患者耐受性差等缺點(diǎn)影響了其臨床治療效果[2-3]。納米給藥系統(tǒng)的迅速發(fā)展為癌癥的臨床治療開(kāi)辟了新的方向，通過(guò)給藥系統(tǒng)的包載可以有效降低藥物的毒副作用，增加藥物的穩(wěn)定性，降低給藥劑量。此外，納米給藥系統(tǒng)的應(yīng)用還可以增加藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)緩釋給藥等作用。

青蒿琥酯（artesunate，ART）是青蒿素衍生物，一直是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，對(duì)很多腫瘤具有較好的抑制作用[4-5]。Efferth 等[6]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等都有較好的抑制作用。然而，ART 的溶解度較低，遇水容易降解，半衰期短，對(duì)腫瘤選擇性較差，生物利用度低，無(wú)法發(fā)揮較好的抗腫瘤效果[7]，限制了臨床應(yīng)用。因此，將其制備成新型納米制劑是一個(gè)理想的選擇。脂質(zhì)體是納米制劑的一種，一般是由磷脂和膽固醇構(gòu)成的一種雙分子層小囊泡，具有類(lèi)似生物膜結(jié)構(gòu)的特性，這種特殊的結(jié)構(gòu)能夠有效改善藥物水溶效果，維持藥物活性，提高藥物的生物利用度[8-12]。磷脂和膽固醇是構(gòu)成細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分，因此脂質(zhì)體表現(xiàn)出良好的生物相容性，通過(guò)與靶標(biāo)細(xì)胞的吸附與融合能實(shí)現(xiàn)藥物的有效輸送。

雖然青蒿琥酯脂質(zhì)體（ART-liposome）的文獻(xiàn)已有報(bào)道，但大多側(cè)重作用機(jī)制、功能修飾及對(duì)肝癌的治療等，缺乏對(duì)ART-liposome 制備處方工藝及抗非小細(xì)胞肺癌的研究。因此，本文在前期篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)關(guān)鍵的制備處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備出粒徑均勻的ART-liposome，并對(duì)其體外抗非小細(xì)胞肺癌作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀（英國(guó)Malvern儀器有限公司）；JEM-2100 透射電鏡（日本日立公司）；UV-2550 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；Multiskan GO 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Science 公司）；Ti2-E＋A1 激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 試藥與細(xì)胞

氫化大豆磷脂（HSPC，德國(guó)Lipoid GmbH）；膽固醇（阿拉丁試劑有限公司）；青蒿琥酯（上海麥克林生化科技有限公司）；多聚甲醛、氯仿、二甲亞砜（DMSO）（國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher Science公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、青霉素-鏈霉素（上海生工生物工程有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、DAPI 染色液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Calcein-AM/PI 細(xì)胞雙染試劑盒（Abcam 試劑有限公司）；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體處方篩選及制備

采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體并對(duì)HSPC 和膽固醇的比例（摩爾比分別為2.0∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.5）進(jìn)行篩選。以1.0∶1.0 為例，稱(chēng)取等摩爾比的HSPC 和膽固醇溶于適量氯仿，將溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，至圓底燒瓶上形成一層均勻的薄膜，將圓底燒瓶置于真空干燥箱24 h，進(jìn)一步除去氯仿。干燥結(jié)束后在圓底燒瓶中加入10 mL 去離子水，超聲破碎得到脂質(zhì)體。隨后用動(dòng)態(tài)光散射法（DLS）測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及電位。

2.2 納米化時(shí)間篩選

選擇超聲破碎法對(duì)所制得的脂質(zhì)體進(jìn)行處理，為得到尺寸更小、粒徑均一的脂質(zhì)體，筆者對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了篩選。用超聲破碎儀對(duì)按“2.1”項(xiàng)下方法制得的脂質(zhì)體分別進(jìn)行3、5、10、15 min的超聲破碎，隨后采用DLS 測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑及電位。

2.3 載藥脂質(zhì)體的制備及表征

將篩選出的最優(yōu)比例的HSPC 和膽固醇溶于氯仿，并加入適量ART 后，將溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，至圓底燒瓶上形成一層均勻的薄膜，將圓底燒瓶置于真空干燥箱24 h，進(jìn)一步除去氯仿。干燥結(jié)束后在圓底燒瓶中加入10 mL 去離子水超聲破碎得到載藥脂質(zhì)體，并用透析法除去未載入的ART，制備得到ARTliposome。用納米粒度儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑及電位，用透射電鏡（TEM）觀察其形貌。

2.4 藥物釋放

通過(guò)動(dòng)態(tài)透析法研究載藥脂質(zhì)體的體外藥物釋放行為。向透析袋中加入載藥脂質(zhì)體，分別浸泡在20 mL pH 7.4 和5.0 的PBS 中，并置于37 ℃搖床中，搖床轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，在特定的時(shí)間點(diǎn)取出1 mL PBS 用于測(cè)量ART，并補(bǔ)充相同體積新的PBS。利用紫外分光光度法測(cè)定ART 的釋放量（Er）。計(jì)算公式如下：

取樣體積和釋放介質(zhì)的總體積分別以Ve和V0表示，膠束中藥物含量以m表示；第i次取樣時(shí)樣品濃度以Ci表示。

2.5 脂質(zhì)體細(xì)胞毒性

采用MTT 法考察脂質(zhì)體的體外毒性，并選擇A549 細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型。將細(xì)胞以6000個(gè)/孔的密度鋪于96 孔板中，然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 使其貼壁生長(zhǎng)，棄去原培養(yǎng)基并補(bǔ)加100 μL 含不同質(zhì)量濃度空白脂質(zhì)體或載藥脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h 后每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg·mL－1），孵育4 h。隨后棄去MTT 溶液，加入相同體積的DMSO 溶解藍(lán)紫色晶體，在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率，以未經(jīng)脂質(zhì)體處理的細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞存活率（%）＝脂質(zhì)體組吸光度/空白組吸光度×100%。

2.6 細(xì)胞狀態(tài)觀察

將細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度鋪于24 孔板中，然后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 使其貼壁生長(zhǎng)，棄去原培養(yǎng)基并補(bǔ)加1 mL 含不同質(zhì)量濃度的游離藥物和載藥脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h 后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.7 細(xì)胞攝取

將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度鋪于6 孔板中，然后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 使其貼壁生長(zhǎng)，棄去原培養(yǎng)基并補(bǔ)加2 mL 含不同質(zhì)量濃度載藥脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。棄去培養(yǎng)基并用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，每孔加入500 μL 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并離心收集（12 000 r·min－1，10 min），測(cè)定上清液中青蒿琥酯的含量。

2.8 Calcein-AM/PI 細(xì)胞染色

將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度鋪于激光共聚焦小皿中，然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 使其貼壁生長(zhǎng)，棄去原培養(yǎng)基并補(bǔ)加2 mL 不同質(zhì)量濃度的載藥脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h 后用Calcein AM/PI 染色15 min，然后用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 17.0 軟件完成，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間差異通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HSPC 與膽固醇比例篩選

如圖1所示，4 種脂質(zhì)體粒徑都在納米級(jí)，且都帶有負(fù)電性，HSPC 與膽固醇比例為2.0∶1.0 與1.0∶2.5時(shí)，制得的脂質(zhì)體粒徑較大且分布不均勻，PDI 也較大；比例為1.0∶1.0 與1.0∶1.5，粒徑較小且分布較為均勻，其中1.0∶1.0 制備的脂質(zhì)體負(fù)電荷更強(qiáng)，更有利于其血清穩(wěn)定性，因此選擇HSPC 與膽固醇比例為1.0∶1.0 進(jìn)行脂質(zhì)體制備。

圖1 HSPC 與膽固醇不同摩爾比脂質(zhì)體的粒徑（A）、電位（B）以及PDI（C）Fig 1 Effect of different molar ratios of HSPC and cholesterol on the liposome particle size（A），zeta potential（B）and PDI（C）

3.2 超聲時(shí)間篩選

通過(guò)DLS 測(cè)定不同超聲時(shí)間處理的脂質(zhì)體的粒徑和PDI，結(jié)果如圖2所示。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)體的粒徑逐漸減小，超聲破碎10 min時(shí)脂質(zhì)體的粒徑在110～120 nm 且分布均勻（PDI約為0.25），經(jīng)腫瘤增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）可以有效地蓄積在靶標(biāo)部位。但是在超聲15 min 時(shí)粒徑分布圖顯示出現(xiàn)雙峰，PDI 也逐漸增大，推測(cè)是過(guò)度超聲破壞了脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，部分脂質(zhì)體發(fā)生絮凝，因此超聲時(shí)間選擇10 min。

圖2 不同超聲時(shí)間制備的脂質(zhì)體的粒徑（A）、PDI（B）以及粒徑分布圖（C）Fig 2 Effect of different ultrasonic times on the liposomes particle size（A），PDI（B）and particle size distribution（C）

3.3 載藥脂質(zhì)體的表征

如圖3所示，ART-liposome 粒徑為（120±5.01）nm，TEM 結(jié)果顯示ART-liposome 呈規(guī)則的球形，且大小均勻。這一特點(diǎn)可使脂質(zhì)體不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，并經(jīng)EPR 效應(yīng)蓄積到靶標(biāo)部位[13]。ARTliposome 的包封率為（92.45±3.57）%，載藥量為（15.72±1.31）%，表明脂質(zhì)體對(duì)ART 具有良好的包載藥物的能力。

圖3 載藥脂質(zhì)體的TEM 圖（A）和粒徑圖（B）Fig 3 TEM image（A）and particle size distribution（B）of ARTliposome

3.4 體外藥物釋放

如圖4所示，載藥脂質(zhì)體在pH 7.4 的PBS 中累積釋放率在30%左右，說(shuō)明脂質(zhì)體在血液中維持良好的穩(wěn)定性，可以有效減少血液輸送過(guò)程中的藥物泄露，降低對(duì)正常組織的毒副作用。然而，ART-liposome 在pH 5.0 的PBS 中累積釋放率達(dá)到了60%。這可能是由于青蒿琥酯在弱酸性環(huán)境中的溶解度比中性條件下高，擴(kuò)大藥物在脂質(zhì)體和溶出介質(zhì)中的濃度差，更有利于藥物的溶出。以上結(jié)果表明載藥脂質(zhì)體在腫瘤部位酸性條件下可以釋放出藥物，增加腫瘤部位藥物蓄積量，提高治療效果。

圖4 不同pH 條件下載藥脂質(zhì)體的藥物釋放情況Fig 4 Drug release of ART-liposome at different pH condition

3.5 體外細(xì)胞毒性

如圖5A 所示，即使空白脂質(zhì)體的濃度達(dá)到500 μg·mL－1，細(xì)胞存活率仍高于85%，說(shuō)明空白脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒。以游離ART 作為對(duì)照組，通過(guò)MTT 法考察了載藥脂質(zhì)體在48 h 的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，隨著ART 濃度的增加細(xì)胞存活率下降，且游離ARTIC50值在24 h 和48 h 分別為（58.79±5.1）μg·mL－1和（81.94±8.4）μg·mL－1，游離藥物細(xì)胞毒性藥強(qiáng)于ART-liposome（見(jiàn)圖5B）（P＜0.05）。

圖5 空白脂質(zhì)體（A）和ART-liposome（B）在48 h 的細(xì)胞毒性（P＜0.05）Fig 5 Cytotoxicity of blank liposomes（A）and ART-liposome（B）at 48 h（P＜0.05）

3.6 細(xì)胞形態(tài)

如圖6所示，未加藥物的空白培養(yǎng)基中細(xì)胞成明顯的梭形，排列緊密且貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好。而經(jīng)ART-liposome 孵育的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且與濃度成負(fù)相關(guān)，大量細(xì)胞變圓且邊緣發(fā)亮，證明細(xì)胞貼壁不牢，生長(zhǎng)狀態(tài)差或已經(jīng)死亡，說(shuō)明ART-liposome 對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。

圖6 經(jīng)不同質(zhì)量濃度ART 和ART-liposome 處理后細(xì)胞狀態(tài)Fig 6 A549 cells treated with different concentrations of free ART and ART-liposome

3.7 細(xì)胞攝取

如圖7所示，游離ART 的攝取量高于ARTliposome（P＜0.05），這可能是由于小分子藥物ART 依靠被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而脂質(zhì)體則可能通過(guò)胞飲等主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)入細(xì)胞，具有能量依賴(lài)性。此外，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)ARTliposome 的攝取明顯增加，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴(lài)性。

圖7 A549 細(xì)胞對(duì)ART-liposome 的攝取情況（*P＜0.05）Fig 7 Uptake of ART-liposome by A549 cells（*P＜0.05）

3.8 Calcein-AM/PI 細(xì)胞染色

如圖8所示，對(duì)照組細(xì)胞被染成明顯的亮綠色，細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。ART-liposome組有大量細(xì)胞核被染成紅色，且濃度越高死亡數(shù)目越多。被染成綠色的活細(xì)胞形狀不再是梭形，而是呈圓形或橢圓形，表明細(xì)胞狀態(tài)不佳。3D模式下熒光圖更為直觀地表明了這一特點(diǎn)（見(jiàn)圖8B），這說(shuō)明ART-liposome 能夠有效地殺死腫瘤細(xì)胞。

圖8 經(jīng)不同質(zhì)量濃度制劑處理的A549 細(xì)胞熒光平面圖（A）和立體圖（B）Fig 8 Plane fluorescence images（A）and stereo fluorescence images（B）of A549 cells treated with different concentrations of free ART and ART-liposome

4 討論

青蒿素及其衍生物對(duì)乳腺癌、白血病、前列腺癌等多種腫瘤有抑制其生長(zhǎng)的活性，是潛在的高效低毒的新一類(lèi)抗腫瘤藥物。其中，ART 不但對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，還可以增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)藥物的多耐藥性。此外，它有選擇性高、安全性好及劑量低等優(yōu)勢(shì)，符合當(dāng)前抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)思路。然而，由于ART 半衰期短、溶解度低、遇水易降解，難以制成液體制劑，限制了其作為抗腫瘤藥物在臨床的應(yīng)用。

脂質(zhì)體是較為成熟的納米制劑，具有生物相容性和腫瘤靶向性等優(yōu)點(diǎn)，目前已有多種脂質(zhì)體抗腫瘤藥物上市。雖然已有文獻(xiàn)制備ARTliposome，驗(yàn)證了其抗腫瘤作用，但缺乏詳細(xì)的脂質(zhì)體制備方法和工藝，或僅為通過(guò)醋酸鈣梯度法等制備功能化ART-liposome[14-15]，對(duì)具有工業(yè)化潛力的ART-liposome 處方和工藝研究較少。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道ART 可以降低非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與侵襲[16]，增加其放療的敏感性[17]，但ARTliposome 對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療作用尚無(wú)報(bào)道。

因此，本文在前期實(shí)驗(yàn)篩選基礎(chǔ)上，選擇HSPC 和膽固醇為主要處方材料，通過(guò)薄膜分散法優(yōu)化兩者配比，并篩選超聲工藝，制備ARTliposome。最終ART-liposome 粒徑較小，外形均一，具有較高的載藥量。通過(guò)細(xì)胞毒性、生長(zhǎng)狀態(tài)、攝取情況以及染色觀察，驗(yàn)證ART-liposome的體外抗腫瘤活性。雖然結(jié)果顯示游離藥物通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散能夠更快地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，但是，游離藥物水溶性差，并缺乏腫瘤選擇性，可能引起全身不良反應(yīng)。ART-liposome 通過(guò)EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向到腫瘤組織，然后被非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞攝取，發(fā)揮抗腫瘤作用。目前本研究?jī)H通過(guò)體外抗腫瘤評(píng)價(jià)了ART-liposome 作為抗腫瘤新劑型的可行性，動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤作用、體內(nèi)安全性等還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，還可以對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行深入修飾，引入長(zhǎng)循環(huán)、主動(dòng)靶向等特性，制備多功能化ART-liposome。