張微,李君,胡玉霞,張謙,郭佳慶,張丁元,程明杰,常福厚*(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心,呼和浩特 010110;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心,呼和浩特 010110;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特 010110;.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010110)
蒙藥益母草(Leonurus japonicusHoutt.)為唇形科(Lamiaceae)益母草屬(Leonurus)植物益母草的新鮮或干燥地上部分,被收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》和 《本草綱目》,其具有活血化瘀、利尿消腫之功效[1],別名益母艾、苦草、坤草等,其味辛、微苦,性微寒,入心包、肝經(jīng),具有活血化瘀、利尿消腫之功效。益母草主要含有生物堿類、黃酮類和二萜類成分,被蒙醫(yī)視為瘡疾圣藥,是蒙藥處方使用的道地藥材。益母草目前在我國臨床上應(yīng)用越來越廣泛,主要用于月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀痛、心腦血管疾病、血液病等疾病的治療,但現(xiàn)代藥理毒理研究甚少,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系和安全性評價有待深入研究。
目前尚未有研究數(shù)據(jù)來綜合評價益母草對于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。本項目采用植入式生理信號遙測系統(tǒng)(DSI)觀察清醒比格犬灌胃益母草細粉混懸液后對于心血管系統(tǒng)的影響;通過大鼠運動協(xié)調(diào)試驗、小鼠自主活動試驗和戊巴比妥鈉閾下催眠試驗,考察益母草對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[2-6]。一方面,為蒙藥益母草的藥用安全性提供科學(xué)依據(jù);另一方面,為內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心將要建立的蒙藥毒理數(shù)據(jù)庫提供資料。
益母草(安國路路通中藥飲片有限公司,批號:20180117,經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教授渠弼鑒定為正品);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(天津市光復(fù)精細化工研究所,批號:20170810);布洛芬緩釋膠囊(中美天津史克制藥有限公司,批號:20171208,規(guī)格:0.3 g/粒);碘伏(文水大有實業(yè)有限公司,批號:20170315);生理鹽水(山東華魯制藥有限公司,批號:D16070503)。
植入式生理信號遙測系統(tǒng)(美國Data Sciences International 公司);動物麻醉機(美國Matrx公司);YLS-1C 小動物活動記錄儀、YLS-31A 大小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀、YLS-27A 大小鼠尾部自動標(biāo)號儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司);DS-Y350 型粉碎機(上海市頂帥工貿(mào)有限公司);CIC1P1-150FE-L 電子秤、BSA4202S 分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);灌注器(蘇州偉康醫(yī)療器械有限公司,批號:170305);胃管(太平洋醫(yī)材股份有限公司,批號:15025519)。
普通級Beagle 犬6 只,5~6月齡,雌雄各半[北京瑪斯生物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0001],動物初次給藥體質(zhì)量:10.45~13.85 kg,飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥物安全性評價中心普通設(shè)施,實驗動物使用許可證號:SYXK(蒙)2014-0003,環(huán)境控制(溫度:18~26℃,日溫差<3℃,濕度:40%~70%,12 h/12 h 明暗交替)。單籠飼養(yǎng),每籠1 只,飼料為購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司的犬維持飼料,定時定量投飼(在動物實驗前禁食過夜),自由攝取,自由飲水。
SPF 級ICR 小鼠80 只,雌雄各半,5~6 周齡,體質(zhì)量:18~22 g;SPF 級SD 大鼠40 只,雌雄各半,5~6 周齡,體質(zhì)量:170~250 g [北京維通利華實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2012-0001]。大、小鼠飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥物安全性評價中心屏障設(shè)施,實驗動物使用許可證號:SYXK(蒙)2014-0003。環(huán)境控制(溫度:20~26℃,日溫差<3℃,相對濕度:41%~64%,換氣次數(shù)≥15 次·h-1,12 h/12 h 明暗交替),飼養(yǎng)密度:5 只/籠,飼料為購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司的60Co 放射滅菌鼠全價顆粒飼料,定時定量投飼(在動物實驗前禁食過夜),自由攝取,自由飲水。
在Data Sciences International 公司工程師指導(dǎo)下,參照DSI D70-PCTR 手術(shù)指南方法進行植入手術(shù),術(shù)前用異氟烷麻醉實驗動物,術(shù)中維持,麻醉后對實驗動物進行充分備皮,主要包括整個胸腹部和腹外側(cè)及前肢內(nèi)側(cè),備皮面積要大于手術(shù)區(qū)域;植入過程主要包括植入子主體植入、壓力導(dǎo)管的植入及電極的植入。植入子主體放于實驗動物腹部左側(cè);心電電極采用模擬標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)放置,實驗動物胸右側(cè)2~3 肋間隙與鎖骨中線相交處為電極負極,胸左側(cè)12~13 肋骨體與腋中線相交處為電極正極;呼吸電極植入結(jié)束后應(yīng)對基線阻抗進行確認,確保呼吸波幅在(60±10)ohms 范圍內(nèi);壓力導(dǎo)管插入腹股溝腹動脈,為防止壓力導(dǎo)管因犬活動拉扯滑出,壓力導(dǎo)管植入后應(yīng)預(yù)留O 型回路并用非吸收線縫合固定。手術(shù)植入及縫合結(jié)束后進入護理周期,術(shù)后給予布洛芬緩釋膠囊3 d,1 次·d-1,1 粒/次,每日使用碘伏對傷口消毒1 次,連續(xù)7 d,恢復(fù)期3~4 周,待全部動物恢復(fù)后開始給藥。
2.2.1 比格犬分組及給藥 6 只比格犬采用拉丁方進行實驗組別設(shè)計,分為4 組,即溶媒對照組(1% CMC-Na),益母草細粉混懸液低、中、高劑量組(0.24、0.72、2.16 g·kg-1)(約相當(dāng)于人臨床擬用劑量倍數(shù)的2、6、18 倍,人體質(zhì)量按70 kg 計算,益母草人臨床擬用量為9 g,即0.12 g·kg-1),設(shè)4 個給藥周期,各給藥周期間隔7 d。實驗組別設(shè)計詳見表1。
表1 益母草細粉混懸液心血管系統(tǒng)安全性藥理組別設(shè)計Tab 1 Design of cardioprotective pharmacology group for leonuri herba suspension
2.2.2 小鼠及大鼠分組及給藥 根據(jù)體質(zhì)量、性別隨機分組,實驗給藥劑量詳見表2。
表2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)安全性藥理劑量設(shè)計Tab 2 Design of central nervous system of leonuri herba suspension
2.3.1 比格犬心電、血壓、體溫試驗 采用植入式生理信號遙測系統(tǒng)采集動物心電、血壓及體溫指標(biāo),心電指標(biāo)包括心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、R 波、ST 段、T 波。記錄給藥前1~2 h 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及給藥后24 h 數(shù)據(jù)。采集間隔為每10 s 系統(tǒng)自動記錄一次。統(tǒng)計時選取給藥前0.5 h(給藥前基礎(chǔ)值)及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、14、18、24 h,取每個時間點后5 min平均值作為該時間點數(shù)據(jù),剔除因動物躁動等因素引起的大幅度漂移數(shù)據(jù)。
2.3.2 小鼠自主活動影響試驗 選用5~6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只,雌雄各半,隨機分為4組,即溶酶對照組(1% CMC-Na),益母草細粉混懸液低、中、高劑量組(1.2、2.4、4.8 g·kg-1),每組10 只,各組別分別經(jīng)口單次灌胃。于給藥前30 min 及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 時間點放入記錄儀的活動箱中,測定各組小鼠活動情況,記錄10 min 內(nèi)的自主活動次數(shù)。
2.3.3 小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠影響試驗 選用5~6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只,雌雄各半,隨機分為4 組,即溶酶對照組(1% CMCNa),益母草細粉混懸液低、中、高劑量組(1.2、2.4、4.8 g·kg-1),每組10 只。于給藥后6 h 腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥鈉,注射體積均為10 mL·kg-1(質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1),即刻開始觀察注射戊巴比妥鈉30 min 內(nèi)每組翻正反射消失達1 min 以上的動物數(shù),凡30 min 內(nèi)動物翻正反射消失達1 min 以上者,表明發(fā)生了睡眠,翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒,翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間。記錄每組發(fā)生睡眠的小鼠數(shù)和入睡潛伏期、睡眠時間。
2.3.4 大鼠協(xié)調(diào)運動的影響試驗 SD 大鼠置于大小鼠轉(zhuǎn)棒儀滾筒上訓(xùn)練,轉(zhuǎn)速為12 r·min—1。訓(xùn)練結(jié)束后,選取能在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上維持3 min 以上不掉落的大鼠40 只,雌雄各半,按潛伏期分為4 組,即溶酶對照組(1% CMC-Na),益母草細粉混懸液低、中、高劑量組(0.81、1.62、3.24 g·kg-1),每組10 只。分別經(jīng)口灌胃給藥。分別于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 將大鼠放在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上,記錄每只大鼠從轉(zhuǎn)棒儀滾筒上掉落所用時間,若10 min 以上不掉落則以10 min 計。
計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。用Levene’s test 方法檢驗方差齊性,若方差齊用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析,兩組間用LSD test(參數(shù)法)進行比較分析。若方差不齊,用Kruskal-Wallis 檢驗,兩組間用Dunnett’s Test(非參數(shù)方法)進行比較分析。
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,蒙藥益母草細粉混懸液高、中、低劑量組清醒比格犬的心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P波、T 波、ST 段及R 波均未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05),結(jié)果如圖1所示。
圖1 益母草細粉混懸液對清醒比格犬各項指標(biāo)的影響Fig 1 Effect of leonuri herba suspension on indicators of conscious Beagle dogs
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,益母草細粉混懸液低、中、高劑量組對清醒Beagle 犬的收縮壓、舒張壓及平均壓均未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05),結(jié)果如圖2所示。
圖2 益母草細粉混懸液對清醒比格犬收縮壓(A)、舒張壓(B)和平均壓(C)的影響Fig 2 Effect of leonuri herba suspension on systolic blood pressure(A),diastolic pressure(B),and average pressure(C)of conscious Beagle dogs
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,益母草細粉混懸液低、中、高劑量組體溫未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05),結(jié)果如圖3所示。
圖3 益母草細粉混懸液對清醒比格犬體溫的影響Fig 3 Effect of leonuri herba suspension on temperature of conscious Beagle dogs
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,益母草細粉混懸液低、中、高劑量組自主活動次數(shù)未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05),結(jié)果如圖4所示。
圖4 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠自主活動的影響Fig 4 Effect of leonuri herba suspension on spontaneous activity of ICR mice
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,益母草細粉混懸液低、中、高劑量組睡眠潛伏期及睡眠時間均未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05),結(jié)果如圖5所示。
圖5 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的影響Fig 5 Effect of leonuri herba suspension on sleep latency and sleep time of ICR mice
與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比,益母草細粉混懸液低、中、高劑量組大鼠協(xié)調(diào)運動未出現(xiàn)明顯改變(P>0.05),結(jié)果如圖6所示。
圖6 益母草細粉混懸液對SD 大鼠協(xié)調(diào)運動的影響Fig 6 Effect of leonuri herba suspension on coordinated exercise of SD rats
安全藥理學(xué)是考察受試藥物在治療范圍以內(nèi)或治療范圍以上劑量時,潛在的不期望出現(xiàn)的對生理功能的不良影響,即觀察藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響[7-11];目前諸多關(guān)于心血管系統(tǒng)安全藥理學(xué)的研究多采用麻醉或束縛狀態(tài)下的實驗動物,麻醉或束縛狀態(tài)下所采集的心電、血壓及體溫等參數(shù)可能會對實驗產(chǎn)生較大的影響,在研究特殊藥物時,可能還會與受試藥物產(chǎn)生相互作用;ICH-S7A《人用藥物安全藥理學(xué)研究指導(dǎo)原則》建議采用清醒動物遙測技術(shù)進行心血管系統(tǒng)實驗,最大限度降低因麻醉劑、人為操作、動物應(yīng)激等因素對實驗產(chǎn)生的干擾[12-14]。結(jié)果表明,益母草細粉混懸液在0.24~2.16 g·kg-1劑量范圍內(nèi)對清醒比格犬的心電、血壓及體溫?zé)o明顯影響;在1.2~4.8 g·kg-1劑量范圍內(nèi)對ICR 小鼠自主活動、睡眠潛伏期及睡眠時間無明顯影響;在0.81~3.24 g·kg-1劑量范圍內(nèi)對SD 大鼠協(xié)調(diào)運動無明顯影響。