張微，李君，胡玉霞，張謙，郭佳慶，張丁元，程明杰，常福厚*（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110）

蒙藥益母草（Leonurus japonicusHoutt.）為唇形科（Lamiaceae）益母草屬（Leonurus）植物益母草的新鮮或干燥地上部分，被收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》和 《本草綱目》，其具有活血化瘀、利尿消腫之功效[1]，別名益母艾、苦草、坤草等，其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝經(jīng)，具有活血化瘀、利尿消腫之功效。益母草主要含有生物堿類、黃酮類和二萜類成分，被蒙醫(yī)視為瘡疾圣藥，是蒙藥處方使用的道地藥材。益母草目前在我國臨床上應(yīng)用越來越廣泛，主要用于月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀痛、心腦血管疾病、血液病等疾病的治療，但現(xiàn)代藥理毒理研究甚少，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系和安全性評價有待深入研究。

目前尚未有研究數(shù)據(jù)來綜合評價益母草對于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。本項目采用植入式生理信號遙測系統(tǒng)（DSI）觀察清醒比格犬灌胃益母草細粉混懸液后對于心血管系統(tǒng)的影響；通過大鼠運動協(xié)調(diào)試驗、小鼠自主活動試驗和戊巴比妥鈉閾下催眠試驗，考察益母草對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[2-6]。一方面，為蒙藥益母草的藥用安全性提供科學(xué)依據(jù)；另一方面，為內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心將要建立的蒙藥毒理數(shù)據(jù)庫提供資料。

1 材料

1.1 試藥

益母草（安國路路通中藥飲片有限公司，批號：20180117，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教授渠弼鑒定為正品）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號：20170810）；布洛芬緩釋膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號：20171208，規(guī)格：0.3 g/粒）；碘伏（文水大有實業(yè)有限公司，批號：20170315）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號：D16070503）。

1.2 儀器

植入式生理信號遙測系統(tǒng)（美國Data Sciences International 公司）；動物麻醉機（美國Matrx公司）；YLS-1C 小動物活動記錄儀、YLS-31A 大小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀、YLS-27A 大小鼠尾部自動標(biāo)號儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；DS-Y350 型粉碎機（上海市頂帥工貿(mào)有限公司）；CIC1P1-150FE-L 電子秤、BSA4202S 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；灌注器（蘇州偉康醫(yī)療器械有限公司，批號：170305）；胃管（太平洋醫(yī)材股份有限公司，批號：15025519）。

1.3 實驗動物

普通級Beagle 犬6 只，5～6月齡，雌雄各半[北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0001]，動物初次給藥體質(zhì)量：10.45～13.85 kg，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥物安全性評價中心普通設(shè)施，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003，環(huán)境控制（溫度：18～26℃，日溫差＜3℃，濕度：40%～70%，12 h/12 h 明暗交替）。單籠飼養(yǎng)，每籠1 只，飼料為購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司的犬維持飼料，定時定量投飼（在動物實驗前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

SPF 級ICR 小鼠80 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質(zhì)量：18～22 g；SPF 級SD 大鼠40 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質(zhì)量：170～250 g [北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001]。大、小鼠飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥物安全性評價中心屏障設(shè)施，實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003。環(huán)境控制（溫度：20～26℃，日溫差＜3℃，相對濕度：41%～64%，換氣次數(shù)≥15 次·h－1，12 h/12 h 明暗交替），飼養(yǎng)密度：5 只/籠，飼料為購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司的60Co 放射滅菌鼠全價顆粒飼料，定時定量投飼（在動物實驗前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

2 方法

2.1 手術(shù)及護理

在Data Sciences International 公司工程師指導(dǎo)下，參照DSI D70-PCTR 手術(shù)指南方法進行植入手術(shù)，術(shù)前用異氟烷麻醉實驗動物，術(shù)中維持，麻醉后對實驗動物進行充分備皮，主要包括整個胸腹部和腹外側(cè)及前肢內(nèi)側(cè)，備皮面積要大于手術(shù)區(qū)域；植入過程主要包括植入子主體植入、壓力導(dǎo)管的植入及電極的植入。植入子主體放于實驗動物腹部左側(cè)；心電電極采用模擬標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)放置，實驗動物胸右側(cè)2～3 肋間隙與鎖骨中線相交處為電極負極，胸左側(cè)12～13 肋骨體與腋中線相交處為電極正極；呼吸電極植入結(jié)束后應(yīng)對基線阻抗進行確認，確保呼吸波幅在（60±10）ohms 范圍內(nèi)；壓力導(dǎo)管插入腹股溝腹動脈，為防止壓力導(dǎo)管因犬活動拉扯滑出，壓力導(dǎo)管植入后應(yīng)預(yù)留O 型回路并用非吸收線縫合固定。手術(shù)植入及縫合結(jié)束后進入護理周期，術(shù)后給予布洛芬緩釋膠囊3 d，1 次·d－1，1 粒/次，每日使用碘伏對傷口消毒1 次，連續(xù)7 d，恢復(fù)期3～4 周，待全部動物恢復(fù)后開始給藥。

2.2 分組及給藥

2.2.1 比格犬分組及給藥 6 只比格犬采用拉丁方進行實驗組別設(shè)計，分為4 組，即溶媒對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（0.24、0.72、2.16 g·kg－1）（約相當(dāng)于人臨床擬用劑量倍數(shù)的2、6、18 倍，人體質(zhì)量按70 kg 計算，益母草人臨床擬用量為9 g，即0.12 g·kg－1），設(shè)4 個給藥周期，各給藥周期間隔7 d。實驗組別設(shè)計詳見表1。

表1 益母草細粉混懸液心血管系統(tǒng)安全性藥理組別設(shè)計Tab 1 Design of cardioprotective pharmacology group for leonuri herba suspension

2.2.2 小鼠及大鼠分組及給藥 根據(jù)體質(zhì)量、性別隨機分組，實驗給藥劑量詳見表2。

表2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)安全性藥理劑量設(shè)計Tab 2 Design of central nervous system of leonuri herba suspension

2.3 數(shù)據(jù)采集

2.3.1 比格犬心電、血壓、體溫試驗 采用植入式生理信號遙測系統(tǒng)采集動物心電、血壓及體溫指標(biāo)，心電指標(biāo)包括心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、R 波、ST 段、T 波。記錄給藥前1～2 h 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及給藥后24 h 數(shù)據(jù)。采集間隔為每10 s 系統(tǒng)自動記錄一次。統(tǒng)計時選取給藥前0.5 h（給藥前基礎(chǔ)值）及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、14、18、24 h，取每個時間點后5 min平均值作為該時間點數(shù)據(jù)，剔除因動物躁動等因素引起的大幅度漂移數(shù)據(jù)。

2.3.2 小鼠自主活動影響試驗 選用5～6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機分為4組，即溶酶對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（1.2、2.4、4.8 g·kg－1），每組10 只，各組別分別經(jīng)口單次灌胃。于給藥前30 min 及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 時間點放入記錄儀的活動箱中，測定各組小鼠活動情況，記錄10 min 內(nèi)的自主活動次數(shù)。

2.3.3 小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠影響試驗 選用5～6 周齡SPF 級ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機分為4 組，即溶酶對照組（1% CMCNa），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（1.2、2.4、4.8 g·kg－1），每組10 只。于給藥后6 h 腹腔注射30 mg·kg－1戊巴比妥鈉，注射體積均為10 mL·kg－1（質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL－1），即刻開始觀察注射戊巴比妥鈉30 min 內(nèi)每組翻正反射消失達1 min 以上的動物數(shù)，凡30 min 內(nèi)動物翻正反射消失達1 min 以上者，表明發(fā)生了睡眠，翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間。記錄每組發(fā)生睡眠的小鼠數(shù)和入睡潛伏期、睡眠時間。

2.3.4 大鼠協(xié)調(diào)運動的影響試驗 SD 大鼠置于大小鼠轉(zhuǎn)棒儀滾筒上訓(xùn)練，轉(zhuǎn)速為12 r·min—1。訓(xùn)練結(jié)束后，選取能在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上維持3 min 以上不掉落的大鼠40 只，雌雄各半，按潛伏期分為4 組，即溶酶對照組（1% CMC-Na），益母草細粉混懸液低、中、高劑量組（0.81、1.62、3.24 g·kg－1），每組10 只。分別經(jīng)口灌胃給藥。分別于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 將大鼠放在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上，記錄每只大鼠從轉(zhuǎn)棒儀滾筒上掉落所用時間，若10 min 以上不掉落則以10 min 計。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。用Levene’s test 方法檢驗方差齊性，若方差齊用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析，兩組間用LSD test（參數(shù)法）進行比較分析。若方差不齊，用Kruskal-Wallis 檢驗，兩組間用Dunnett’s Test（非參數(shù)方法）進行比較分析。

3 結(jié)果

3.1 益母草細粉混懸液對清醒比格犬心血管系統(tǒng)的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，蒙藥益母草細粉混懸液高、中、低劑量組清醒比格犬的心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P波、T 波、ST 段及R 波均未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖1所示。

圖1 益母草細粉混懸液對清醒比格犬各項指標(biāo)的影響Fig 1 Effect of leonuri herba suspension on indicators of conscious Beagle dogs

3.2 益母草細粉混懸液對清醒比格犬血壓的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組對清醒Beagle 犬的收縮壓、舒張壓及平均壓均未產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05），結(jié)果如圖2所示。

圖2 益母草細粉混懸液對清醒比格犬收縮壓（A）、舒張壓（B）和平均壓（C）的影響Fig 2 Effect of leonuri herba suspension on systolic blood pressure（A），diastolic pressure（B），and average pressure（C）of conscious Beagle dogs

3.3 益母草細粉混懸液對清醒比格犬體溫的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組體溫未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖3所示。

圖3 益母草細粉混懸液對清醒比格犬體溫的影響Fig 3 Effect of leonuri herba suspension on temperature of conscious Beagle dogs

3.4 益母草細粉混懸液對小鼠自主活動的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組自主活動次數(shù)未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖4所示。

圖4 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠自主活動的影響Fig 4 Effect of leonuri herba suspension on spontaneous activity of ICR mice

3.5 益母草細粉混懸液對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組睡眠潛伏期及睡眠時間均未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖5所示。

圖5 益母草細粉混懸液對ICR 小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的影響Fig 5 Effect of leonuri herba suspension on sleep latency and sleep time of ICR mice

3.6 蒙藥益母草細粉混懸液對大鼠協(xié)調(diào)運動的影響

與溶媒對照組同一采集時間點的數(shù)值相比，益母草細粉混懸液低、中、高劑量組大鼠協(xié)調(diào)運動未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖6所示。

圖6 益母草細粉混懸液對SD 大鼠協(xié)調(diào)運動的影響Fig 6 Effect of leonuri herba suspension on coordinated exercise of SD rats

4 結(jié)論與討論

安全藥理學(xué)是考察受試藥物在治療范圍以內(nèi)或治療范圍以上劑量時，潛在的不期望出現(xiàn)的對生理功能的不良影響，即觀察藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的影響[7-11]；目前諸多關(guān)于心血管系統(tǒng)安全藥理學(xué)的研究多采用麻醉或束縛狀態(tài)下的實驗動物，麻醉或束縛狀態(tài)下所采集的心電、血壓及體溫等參數(shù)可能會對實驗產(chǎn)生較大的影響，在研究特殊藥物時，可能還會與受試藥物產(chǎn)生相互作用；ICH-S7A《人用藥物安全藥理學(xué)研究指導(dǎo)原則》建議采用清醒動物遙測技術(shù)進行心血管系統(tǒng)實驗，最大限度降低因麻醉劑、人為操作、動物應(yīng)激等因素對實驗產(chǎn)生的干擾[12-14]。結(jié)果表明，益母草細粉混懸液在0.24～2.16 g·kg－1劑量范圍內(nèi)對清醒比格犬的心電、血壓及體溫?zé)o明顯影響；在1.2～4.8 g·kg－1劑量范圍內(nèi)對ICR 小鼠自主活動、睡眠潛伏期及睡眠時間無明顯影響；在0.81～3.24 g·kg－1劑量范圍內(nèi)對SD 大鼠協(xié)調(diào)運動無明顯影響。