◎ 刁玉華,張加穩(wěn)
(昆明市食品藥品檢驗(yàn)所,云南 昆明 650032)
金剛烷胺是飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物,屬于三環(huán)胺類。1966年,人類首次研究發(fā)現(xiàn)金剛烷胺具有抗病毒的功效,其于1976年成為美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)首次批準(zhǔn)的抗病毒藥物,主要用于預(yù)防亞洲甲型流感病毒的感染,臨床上還被用于治療帕金森綜合征、丙型肝炎和多發(fā)性硬化癥[1-2]。大型流感的爆發(fā)會造成畜禽動物極高的發(fā)病率和死亡率,養(yǎng)殖戶為降低經(jīng)濟(jì)損失,將金剛烷胺類藥物添加至飼料中用于畜禽流感的預(yù)防和治療,然而非法使用金剛烷胺類藥物會造成動物體內(nèi)藥物殘留,加大病毒的耐藥性和變異性,人體食用后會損傷生殖系統(tǒng)[3-4]。因此,包括我國在內(nèi)的多個國家已將金剛烷胺列為禁用藥物,且2017年原農(nóng)業(yè)部印發(fā)的《關(guān)于動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃的通知》將其定為首個監(jiān)控項(xiàng)目[5]。
目前,金剛烷胺的檢測方法有高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、電化學(xué)法[10]、微流控芯片法[11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)成為近年獸藥殘留檢測分析的主要方法,具有靈敏度高、基質(zhì)干擾小、高通量及定性定量更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。查閱文獻(xiàn)可知,關(guān)于肉制品中金剛烷胺殘留量檢測的相關(guān)報道較多[14-16],提取溶劑多采用甲醇或乙腈與有機(jī)酸混合提取,而進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》(SN/T 4253—2015)[17]僅以三氯乙酸作為提取溶劑,提取液均用混合陽離子固相萃取柱凈化,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)上述方法的提取效率和重現(xiàn)性均不理想,而關(guān)于其他提取溶劑和固相萃取柱的相關(guān)研究報道又較少。故本實(shí)驗(yàn)選取市售雞蛋為基質(zhì)樣品,分別對提取溶劑、固相萃取柱進(jìn)行優(yōu)化研究,最終建立了系統(tǒng)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,可為雞蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析提供理論指導(dǎo)。
試劑:甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯及異丙醇,均為色譜純,購自默克股份兩合公司;甲酸、乙酸、三氯乙酸、鹽酸、氨水、乙酸銨,均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
材料:金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院),Cleanert C18、Oasis HLB、PCX、MCX、SCX、WCX共6種固相萃取柱(均為天津博納艾杰爾科技有限公司),BHE Amide色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,美國沃特世公司)。
QTRAP 4500超高效液相-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源ESI及MultiQuant3.0.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),美國AB SCIEX公司)、JJ500電子天平(常熟市雙杰測試儀器)、SK8210HP超聲波清洗儀(上海科導(dǎo))、Reacti-Therm氮吹儀(美國賽默飛世爾公司)、arium? comfort II超純水機(jī)(德國賽多利斯公司)、S220K精密pH計(梅特勒-托利多公司)。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
精確稱取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>
取100 μg·mL-1的 標(biāo) 準(zhǔn) 儲 備 液 用 乙 腈 配 制 成1 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液,用30%乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)使用液為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,待用。
1.3.2 樣品前處理
(1)實(shí)驗(yàn)樣品制備。選取市售雞蛋去殼用組織搗碎機(jī)搗碎,裝入自封袋中,冷藏、避光保存,備用。
(2)提取。準(zhǔn)確稱取均勻試樣5 g,于50 mL離心管中,加入15 mL乙腈-2.0%三氯乙酸溶液(1∶1,V/V),漩渦混勻3 min,再超聲提取10 min,8 000 r·min-1離心5 min,取出上清液,再重復(fù)提取一次,離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中,用乙腈定容至刻度待凈化。
(3)凈化。依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸活化混合陽離子交換固相萃取小柱,準(zhǔn)確移取5 mL稀釋液過柱,依次用5 mL甲酸溶液、3 mL1%甲酸乙腈淋洗,棄去全部流出液;用2×2 mL甲醇-氨水-乙酸銨(95+2.5+2.5)洗脫至10 mL試管中,在40 ℃下用氮吹儀吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水(70+10+20)溶解殘渣,過0.22 μm濾膜,供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件
(1)液相條件。流速:0.3 mL·min-1;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相A為含0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈,洗脫梯度見表1。
表1 梯度洗脫條件表
(2)質(zhì)譜條件。ESI-MS/MS條件:正離子掃描;MRM多反應(yīng)監(jiān)測;氣簾氣流速為38 L·h-1,離子源霧化氣流速為55 L·h-1,離子源輔助加熱氣流速為55 L·h-1,噴霧電壓5 500 V,加熱器溫度為550 ℃;優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見表2。
表2 金剛烷胺保留時間及質(zhì)譜參數(shù)表
金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基基團(tuán),在質(zhì)譜檢測離子化過程中,容易形成穩(wěn)定的[M+H]+離子,故采用電噴霧正離子(ESI+)掃描模式。正離子掃描模式下,在液相色譜流動相中加入少量的甲酸會增強(qiáng)待測化合物的響應(yīng)強(qiáng)度,原因是甲酸會電離出更多的H+,因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%的甲酸水溶液與乙腈為流動相,由于金剛烷胺含有胺基基團(tuán),極性較強(qiáng),故采用BHE Amide色 譜 柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,Waters)進(jìn)行梯度洗脫,保證有較好的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度。建立優(yōu)化后的液相色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)后對加標(biāo)樣品溶液采集的離子色譜峰圖分別如圖1所示。
圖1 金剛烷胺加標(biāo)溶液的MRM離子色譜圖
2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化
金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)含有胺基,極性較強(qiáng),根據(jù)相似相溶原理,易溶于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑中,故本實(shí)驗(yàn)分別比較甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷以及乙酸乙酯等不同極性的有機(jī)溶劑分別與2.0%的甲酸、乙酸、鹽酸和三氯乙酸等以1∶1體積混合進(jìn)行提取。其中,異丙醇-2.0%三氯乙酸(1∶1,V/V)作為提取溶劑的提取效果最好,原因可能是金剛烷胺的極性與異丙醇相似,且三氯乙酸可沉淀蛋白,減少基質(zhì)干擾,因此本實(shí)驗(yàn)選用異丙醇-2.0%三氯乙酸(1∶1,V/V)作為提取溶劑。
2.2.2 凈化柱的優(yōu)化
金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基,在酸性條件下呈陽離子狀態(tài),故目前實(shí)驗(yàn)室多采用陽離子交換固相萃取柱對提取液進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)分別比較了MCX、PCX、SCX、WCX、HLB和C18固相萃取柱對目標(biāo)物提取液的凈化效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2 不同固相萃取柱凈化下金剛烷胺的提取回收率圖
由圖2可知,采用Oasis MCX比其他5種固相萃取柱凈化回收率高,原因可能是其填料對金剛烷胺所形成的[M+H]+離子吸附作用較強(qiáng),且易于洗脫,因此本實(shí)驗(yàn)選擇Oasis MCX作為固相凈化柱。
金剛烷胺的質(zhì)量濃度在5.0~100.0 ng·mL-1時,其目標(biāo)物定量離子對的峰面積與其質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 1,線性回歸方程為y=48 324x +174 820。以信噪比S/N=3時對應(yīng)的濃度作為方法的檢出限,信噪比S/N=10時對應(yīng)的濃度為定量限,得到金剛烷胺的檢出限為0.3 μg·kg-1,定量限為1.0 μg·kg-1。
在空白樣品中分別添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個濃度水平的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn),按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測定,計算其加標(biāo)回收率及精密度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,加標(biāo)樣品中金剛烷胺的平均回收率為87.5%~97.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%,GB/T 27404—2008規(guī)定被測組分含量小于100 μg·kg-1,回收率為60%~120%、精密度21%~30%[18],可見本方法加標(biāo)回收率和精密度較好。
表3 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表(n=6)
本文建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中金剛烷胺殘留量的分析方法。分別對提取溶劑、固相萃取柱、儀器條件做了優(yōu)化研究,優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法為以異丙醇-2.0%三氯乙酸(1∶1,V/V)為提取溶劑、以O(shè)asis MCX為固相萃取凈化柱對樣品進(jìn)行前處理,再以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相,采用ESI正離子模式電離,多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本方法相關(guān)系數(shù)為0.999 1,檢出限為0.3 μg·kg-1,定量限為1.0 μg·kg-1,回收率為87.5%~97.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%??梢娫摲椒ú僮骱啽?、快速,前處理干凈,基質(zhì)干擾小,回收率高、重復(fù)性好,滿足大批量禽蛋中金剛烷胺殘留量的檢測分析。