◎ 刁玉華，張加穩(wěn)

（昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650032）

金剛烷胺是飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物，屬于三環(huán)胺類。1966年，人類首次研究發(fā)現(xiàn)金剛烷胺具有抗病毒的功效，其于1976年成為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）首次批準(zhǔn)的抗病毒藥物，主要用于預(yù)防亞洲甲型流感病毒的感染，臨床上還被用于治療帕金森綜合征、丙型肝炎和多發(fā)性硬化癥[1-2]。大型流感的爆發(fā)會(huì)造成畜禽動(dòng)物極高的發(fā)病率和死亡率，養(yǎng)殖戶為降低經(jīng)濟(jì)損失，將金剛烷胺類藥物添加至飼料中用于畜禽流感的預(yù)防和治療，然而非法使用金剛烷胺類藥物會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留，加大病毒的耐藥性和變異性，人體食用后會(huì)損傷生殖系統(tǒng)[3-4]。因此，包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家已將金剛烷胺列為禁用藥物，且2017年原農(nóng)業(yè)部印發(fā)的《關(guān)于動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃的通知》將其定為首個(gè)監(jiān)控項(xiàng)目[5]。

目前，金剛烷胺的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9]、電化學(xué)法[10]、微流控芯片法[11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)成為近年獸藥殘留檢測(cè)分析的主要方法，具有靈敏度高、基質(zhì)干擾小、高通量及定性定量更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。查閱文獻(xiàn)可知，關(guān)于肉制品中金剛烷胺殘留量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較多[14-16]，提取溶劑多采用甲醇或乙腈與有機(jī)酸混合提取，而進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4253—2015）[17]僅以三氯乙酸作為提取溶劑，提取液均用混合陽(yáng)離子固相萃取柱凈化，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)上述方法的提取效率和重現(xiàn)性均不理想，而關(guān)于其他提取溶劑和固相萃取柱的相關(guān)研究報(bào)道又較少。故本實(shí)驗(yàn)選取市售雞蛋為基質(zhì)樣品，分別對(duì)提取溶劑、固相萃取柱進(jìn)行優(yōu)化研究，最終建立了系統(tǒng)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，可為雞蛋中金剛烷胺殘留量的檢測(cè)分析提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯及異丙醇，均為色譜純，購(gòu)自默克股份兩合公司；甲酸、乙酸、三氯乙酸、鹽酸、氨水、乙酸銨，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

材料：金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），Cleanert C18、Oasis HLB、PCX、MCX、SCX、WCX共6種固相萃取柱（均為天津博納艾杰爾科技有限公司），BHE Amide色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，美國(guó)沃特世公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500超高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源ESI及MultiQuant3.0.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)AB SCIEX公司）、JJ500電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器）、SK8210HP超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)）、Reacti-Therm氮吹儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）、arium? comfort II超純水機(jī)（德國(guó)賽多利斯公司）、S220K精密pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）。

1.3 方法與過(guò)程

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μg·mL-1的 標(biāo) 準(zhǔn) 儲(chǔ) 備 液 用 乙 腈 配 制 成1 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液，用30%乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)使用液為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。

1.3.2 樣品前處理

（1）實(shí)驗(yàn)樣品制備。選取市售雞蛋去殼用組織搗碎機(jī)搗碎，裝入自封袋中，冷藏、避光保存，備用。

（2）提取。準(zhǔn)確稱取均勻試樣5 g，于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-2.0%三氯乙酸溶液（1∶1，V/V），漩渦混勻3 min，再超聲提取10 min，8 000 r·min-1離心5 min，取出上清液，再重復(fù)提取一次，離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度待凈化。

（3）凈化。依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 2%甲酸活化混合陽(yáng)離子交換固相萃取小柱，準(zhǔn)確移取5 mL稀釋液過(guò)柱，依次用5 mL甲酸溶液、3 mL1%甲酸乙腈淋洗，棄去全部流出液；用2×2 mL甲醇-氨水-乙酸銨（95+2.5+2.5）洗脫至10 mL試管中，在40 ℃下用氮吹儀吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水（70+10+20）溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）液相條件。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件表

（2）質(zhì)譜條件。ESI-MS/MS條件：正離子掃描；MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；氣簾氣流速為38 L·h-1，離子源霧化氣流速為55 L·h-1，離子源輔助加熱氣流速為55 L·h-1，噴霧電壓5 500 V，加熱器溫度為550 ℃；優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 金剛烷胺保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基基團(tuán)，在質(zhì)譜檢測(cè)離子化過(guò)程中，容易形成穩(wěn)定的[M+H]+離子，故采用電噴霧正離子（ESI+）掃描模式。正離子掃描模式下，在液相色譜流動(dòng)相中加入少量的甲酸會(huì)增強(qiáng)待測(cè)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，原因是甲酸會(huì)電離出更多的H+，因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%的甲酸水溶液與乙腈為流動(dòng)相，由于金剛烷胺含有胺基基團(tuán)，極性較強(qiáng)，故采用BHE Amide色 譜 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Waters）進(jìn)行梯度洗脫，保證有較好的峰形和響應(yīng)強(qiáng)度。建立優(yōu)化后的液相色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)后對(duì)加標(biāo)樣品溶液采集的離子色譜峰圖分別如圖1所示。

圖1 金剛烷胺加標(biāo)溶液的MRM離子色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)含有胺基，極性較強(qiáng)，根據(jù)相似相溶原理，易溶于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑中，故本實(shí)驗(yàn)分別比較甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷以及乙酸乙酯等不同極性的有機(jī)溶劑分別與2.0%的甲酸、乙酸、鹽酸和三氯乙酸等以1∶1體積混合進(jìn)行提取。其中，異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑的提取效果最好，原因可能是金剛烷胺的極性與異丙醇相似，且三氯乙酸可沉淀蛋白，減少基質(zhì)干擾，因此本實(shí)驗(yàn)選用異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）作為提取溶劑。

2.2.2 凈化柱的優(yōu)化

金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中含有胺基，在酸性條件下呈陽(yáng)離子狀態(tài)，故目前實(shí)驗(yàn)室多采用陽(yáng)離子交換固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)分別比較了MCX、PCX、SCX、WCX、HLB和C18固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物提取液的凈化效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同固相萃取柱凈化下金剛烷胺的提取回收率圖

由圖2可知，采用Oasis MCX比其他5種固相萃取柱凈化回收率高，原因可能是其填料對(duì)金剛烷胺所形成的[M+H]+離子吸附作用較強(qiáng)，且易于洗脫，因此本實(shí)驗(yàn)選擇Oasis MCX作為固相凈化柱。

2.3 校準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

金剛烷胺的質(zhì)量濃度在5.0～100.0 ng·mL-1時(shí)，其目標(biāo)物定量離子對(duì)的峰面積與其質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，線性回歸方程為y=48 324x +174 820。以信噪比S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度作為方法的檢出限，信噪比S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，得到金剛烷胺的檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個(gè)濃度水平的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，計(jì)算其加標(biāo)回收率及精密度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，加標(biāo)樣品中金剛烷胺的平均回收率為87.5%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%，GB/T 27404—2008規(guī)定被測(cè)組分含量小于100 μg·kg-1，回收率為60%～120%、精密度21%～30%[18]，可見(jiàn)本方法加標(biāo)回收率和精密度較好。

表3 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中金剛烷胺殘留量的分析方法。分別對(duì)提取溶劑、固相萃取柱、儀器條件做了優(yōu)化研究，優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法為以異丙醇-2.0%三氯乙酸（1∶1，V/V）為提取溶劑、以O(shè)asis MCX為固相萃取凈化柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理，再以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用ESI正離子模式電離，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法相關(guān)系數(shù)為0.999 1，檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，回收率為87.5%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%?？梢?jiàn)該方法操作簡(jiǎn)便、快速，前處理干凈，基質(zhì)干擾小，回收率高、重復(fù)性好，滿足大批量禽蛋中金剛烷胺殘留量的檢測(cè)分析。