◎ 趙 飛
(遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心,遼寧 沈陽 110000)
測量不確定度評定是按照實(shí)際檢測過程和相關(guān)信息對檢測結(jié)果的分散性進(jìn)行評估的一種方式[1]。測量不確定度可以客觀的評價(jià)檢測數(shù)據(jù),尤其是當(dāng)檢測數(shù)據(jù)處于臨界值時(shí),進(jìn)行不確定度評定可以保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。
玉米赤霉烯酮,又稱F-2毒素,是玉米赤霉菌的代謝產(chǎn)物[3-4]。玉米赤霉烯酮易污染玉米、小麥等谷物,尤其是當(dāng)這些谷物儲存不當(dāng)時(shí)更易被污染[5]。它對神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟等有毒害作用。因此本文嚴(yán)格按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》(GB 5009.209—2016)[6]操作,對其檢測結(jié)果的不確定度進(jìn)行評估,為實(shí)驗(yàn)室出具的玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供科學(xué)依據(jù)。
Agilent 1260 Infinity液相色譜儀(美國安捷倫公司)、ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,0.5 μm,美國安捷倫公司)、BSA224S-CW電子天平(德國賽多利斯公司)、GM200高速粉碎機(jī)(德國萊馳公司)、FJ300-SH均質(zhì)器(德國IKA公司)、TTL-DCII氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)、X1R高速冷凍離心機(jī)(德國Thermo公司)。
乙腈、甲醇(色譜純,美國Fisher公司);氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水,均為一級水;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(濃度為100.2 μg·mL-1,ROMER公司)。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確吸取1.0 mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋配制成濃度為1.02 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-18 ℃避光保存。用70%乙腈溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1,標(biāo)準(zhǔn)系列溶液臨用現(xiàn)配。
1.2.2 液相色譜參考條件
色 譜 柱:ZORBAX SB-C18色 譜 柱(4.6 mm×150 mm,0.5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶水=70∶30(v/v);流速:0.7 mL·min-1;柱溫:30 ℃;激發(fā)波長:274 nm;發(fā)射波長:440 nm;進(jìn)樣體積:100 μL。
1.2.3 樣品前處理
稱取40 g試樣(精確至0.1 g)于均質(zhì)杯中,加入4 g氯化鈉、100 mL提取液,高速攪拌提取2 min,過濾。移取10 mL濾液于40 mL水中,經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至澄清;準(zhǔn)確移取10 mL上述濾液至免疫親和柱上,直至有部分空氣進(jìn)入,用5 mL水淋洗柱子一次,再準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇洗脫,流速為1滴/s。收集洗脫液于玻璃試管中,55 ℃下氮?dú)獯蹈?,?.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)^膜待測。
1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立
樣品中玉米赤霉烯酮的含量按式(1)計(jì)算。
式中,ω-樣品中玉米赤霉烯酮的含量,μg·kg-1;ρ-由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中玉米赤霉烯酮的濃度,ng·mL-1;ρ0-空白溶液中玉米赤霉烯酮的濃度,ng·mL-1;V-樣品定容體積,mL;c-系數(shù);A-試樣溶液中玉米赤霉烯酮的色譜峰面積;AS-標(biāo)準(zhǔn)溶液中玉米赤霉烯酮的色譜峰面積;m-稱樣量,g;P-加標(biāo)樣品回收率。
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度ur(c1)
通過查看玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,得到該標(biāo)準(zhǔn)品相對不確定度U=0.2%,k=2,則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度ur(c2)
標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制中用到1 mL的A級單標(biāo)線吸量管、10 mL容量瓶,允許誤差分別為±0.008 mL、±0.020 mL,按照均勻分布考慮,取則吸量管和容量瓶引入的不確定度為:
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室的溫度通常控制在(20±5)℃,20 ℃下乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1,由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引起體積變化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
綜上,標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的不確定度為:
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度ur(c3)
標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中各分量的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1。
表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引入的不確定度表
根據(jù)各分量,標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur(c4)
本方法對濃度依次為10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),以響應(yīng)值峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,校準(zhǔn)曲線方程見表2,并對陰性樣品加標(biāo)進(jìn)行6次平行測定,測得結(jié)果分別為52.0 ng·mL-1、52.6 ng·mL-1、53.2 ng·mL-1、53.3 ng·mL-1、53.0 ng·mL-1和52.8 ng·mL-1,平均值為52.8 ng·mL-1,由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度可由式(2)計(jì)算。
表2 碘化鉀飽和溶液的放置時(shí)間對測定結(jié)果的影響表
表2 玉米赤霉烯酮校準(zhǔn)曲線表
式中,ur(c4)-曲線擬合引入的不確定度;S(A)-標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物質(zhì)信號殘差的標(biāo)準(zhǔn)差;b-校準(zhǔn)曲線的斜率;p-樣品溶液檢測次數(shù)(6次);n-標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)(5次);c0-校準(zhǔn)曲線校正后待測樣品中玉米赤霉烯酮濃度的平均值,ng·mL-1;ci-標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)玉米赤霉烯酮濃度理論值,ng·mL-1;標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)玉米赤霉烯酮濃度的平均值,ng·mL-1。
其中,S(A)可按公式(3)計(jì)算。
式中,n-校準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù);Ai-標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)的峰面積;A-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論峰面積。
由校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(c4)=0.001 88。
綜上,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為:
采用分度為0.1 g的天平稱量待測樣品,該天平在0~50 g稱量范圍內(nèi)的最大允許誤差為±0.05 g,樣品稱量過程引入的相對不確定度為:
樣品前處理過程中采用100 mL量筒,其容量允差為±1.0 mL,在(20±5)℃條件下,由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
移取10 mL提取液的濾液,并加入40 mL水稀釋混勻,10 mL單標(biāo)線吸量管和50 mL刻度吸量管的容量允差為±0.020 mL、±0.10 mL,稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
準(zhǔn)確移取10 mL濾液至免疫親和柱上凈化,最后用1.0 mL流動(dòng)相復(fù)溶,10 mL和1 mL單標(biāo)線吸量管的容量允差為±0.020 mL、±0.007 mL,稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
該過程引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
開展加標(biāo)實(shí)驗(yàn),添加量為70.0 μg·kg-1,測定值分別為65.0 μg·kg-1、65.7 μg·kg-1、66.5 μg·kg-1、66.6 μg·kg-1、66.2 μg·kg-1和66.0 μg·kg-1,平均值為66.0 μg·kg-1。按照A類評定,應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算,待測物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.590,其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
向不含玉米赤霉烯酮的小麥粉中加標(biāo),添加量為70.0 μg·kg-1,通過前處理并檢測計(jì)算,得回收率分別為92.9%、93.9%、95.0%、95.1%、94.6%和94.3%,平均值為94.3%,按照A類評定應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算待測物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.843%,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
用t來檢驗(yàn)確定平均回收率是否與1有顯著差異,當(dāng)n=6,自由度為5時(shí),在置信概率為95%時(shí),t0.95(5)=2.571,該回收率下即t>2.571,需要用回收率對結(jié)果進(jìn)行修正?;厥章室氲南鄬?biāo)準(zhǔn)不確定度為:
采用本方法檢測小麥粉中玉米赤霉烯酮的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
玉米赤霉烯酮的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
在95%置信概率下,擴(kuò)展因子k=2,則采用本方法檢測小麥粉中玉米赤霉烯酮的擴(kuò)展不確定度為U95=k×ur(x)=3.60 μg·kg-1,小麥粉中玉米赤霉烯酮的檢測結(jié)果表示為(66.0±3.60)μg·kg-1;k=2。
采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定小麥粉中玉米赤霉烯酮含量,對檢測結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。通過評定,該實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引入的不確定度貢獻(xiàn)最大。因此,在實(shí)驗(yàn)室采用該方法開展玉米赤霉烯酮檢測時(shí),要注意選用合適的量具,并定期開展檢定校準(zhǔn),嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室溫度,切實(shí)減小不確定度分量,保證檢測數(shù)據(jù)的科學(xué)性和合理性。