張帆，劉威，龍永貴，趙飛，劉凌曦，胡同晨，彭華利，馬智群

（樂山市人民醫(yī)院胸心外科，四川樂山614000）

肺癌是最常見的腫瘤，其中多數(shù)患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），NSCLC 病死率高，危及患者生命安全[1-2]。目前，學(xué)者認(rèn)為NSCLC 發(fā)病與環(huán)境惡化、不良生活習(xí)慣、microRNA（miRNA）及長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA, lncRNA）異常表達(dá)、免疫逃逸、炎癥反應(yīng)、自噬等關(guān)系密切[3]，且lncRNA、miRNA 可相互調(diào)控，共同參與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00265 在急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myelogenous leukemia, AML）患者中表達(dá)上調(diào)，其可能通過影響自噬進(jìn)而抑制癌細(xì)胞凋亡，從而在AML 中發(fā)揮調(diào)控作用[5]；而microRNA-98-5p（miR-98-5p）在NSCLC 中呈低表達(dá)，其可能抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，且可能是治療NSCLC的潛在靶標(biāo)[6]。但lncRNA LINC00265 在NSCLC 患者中的表達(dá)及與miR-98-5p、預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此本研究通過測定NSCLC 患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達(dá)量，分析兩者的相關(guān)性及與預(yù)后的關(guān)系，以期為NSCLC 的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2017年12月在樂山市人民醫(yī)院行根治性切除術(shù)的原發(fā)性NSCLC 患者97 例作為研究對象。其中，男性56 例，女性41 例；年齡45～72 歲，平均（59.03±10.27）歲；年齡＜60 歲35 例，≥60 歲62 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52 例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移45 例；腫瘤≤3 cm 43 例，腫瘤＞3 cm 54 例；臨床分期Ⅰ期30 例，Ⅱ、Ⅲ期67 例；腺癌40 例，鱗癌43 例，其他病理類型14 例；低分化41 例，中、高分化56 例；肺葉切除89 例，單側(cè)全肺切除8 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試對象及家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合NSCLC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)確診為NSCLC[7]；②術(shù)前無放化療者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①臨床資料不完整；②合并嚴(yán)重臟器疾病、其他惡性腫瘤；③存在手術(shù)禁忌證。

1.3 主要試劑及儀器

利用Trizol 試劑（SBJ-L0055，南京森貝伽生物科技有限公司），miRNA 提取試劑盒（R6842-02，北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司），F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit（TER016-1，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），miScript Reverse Transcription Kit（218060，美國Thermo Fisher 公司），TaqMan?Universal Master Mix（4444558，上海恪敏生物科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（StepOneTM，美國ABI 公司）。

1.4 樣本收集

收集NSCLC 患者術(shù)中切除的癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本（距癌組織＞3 cm），置于液氮罐中凍存24 h 后移至-70℃冷凍保存。

1.5 qRT-PCR 檢測組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達(dá)量

解凍凍存組織標(biāo)本，利用Trizol 試劑/miRNA 提取試劑盒抽提總RNA，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit/miScript Reverse Transcription Kit 合成cDNA。采用TaqMan?Universal Master Mix 及qRT-PCR 儀對cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增、檢測。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；93℃變性15 s，64℃退火30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。 lncRNA LINC00265、miR-98-5p 分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 生物信息學(xué)軟件預(yù)測lncRNA LINC00265 與miR-98-5p的關(guān)系

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA＆flag=target＆clade=mammal＆genome=human＆assembly=hg19＆miRNA=all＆clipNum=1＆deNum=0＆panNum=0＆target=LINC00265）對lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測分析。

1.7 隨訪

對97 例NSCLC 患者進(jìn)行隨訪，以手術(shù)當(dāng)日為隨訪起點(diǎn)，電話/門診為主要隨訪方式，2020年12月31日或患者死亡為隨訪終點(diǎn)，記錄患者術(shù)后情況，計(jì)算術(shù)后總生存時(shí)間（overall survival, OS）、無病生存期（disease-free survival,DFS）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，影響因素的分析用Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達(dá)量比較

NSCLC 患者癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌組織lncRNA LINC00265 相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，miR-98-5p 相對表達(dá)量低于癌旁正常組織。見表2。

表2 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達(dá)量比較 （n=97，±s）

表2 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達(dá)量比較 （n=97，±s）

組別lncRNA LINC00265 miR-98-5p癌旁正常組織癌組織t 值P 值1.05±0.35 1.86±0.62 11.205 0.000 1.03±0.34 0.50±0.17 13.732 0.000

2.2 癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系

以lncRNA LINC00265 相對表達(dá)量平均值1.86為界限，分為低表達(dá)（47 例）和高表達(dá)患者（50 例）。以miR-98-5p 相對表達(dá)量平均值0.50 為界限，分為低表達(dá)（49 例）和高表達(dá)患者（48 例）。不同性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、手術(shù)方式患者癌組織的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表達(dá)水平比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期和低分化患者癌組織的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p表達(dá)水平比較 例

2.3 癌組織lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 的相關(guān)性

Pearson 法結(jié)果顯示，NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265與miR-98-5p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.580，P=0.000）（見圖1）。生物信息學(xué)分析顯示，lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，兩者可能存在靶向調(diào)控關(guān)系（見圖2）。

圖1 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265與miR-98-5p的相關(guān)性

圖2 lncRNA LINC00265與miR-98-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.4 癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

97 例NSCLC 患者隨訪36 個(gè)月，其中生存52 例，無病生存49 例。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，NSCLC 患者lncRNA LINC00265 高表達(dá)患者OS為25.44個(gè)月（95%CI：22.45，28.43），DFS為22.88個(gè)月（95%CI：19.81，25.95）；lncRNA LINC00265 低表達(dá)患者OS 為31.62 個(gè)月（95% CI：29.22，34.01），DFS 為31.17 個(gè)月（95%CI：28.66，33.68）。lncRNA LINC00265高表達(dá)與低表達(dá)患者的總生存率、無病生存率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.750 和17.552，P=0.000），lncRNA LINC00265高表達(dá)患者總生存率、無病生存率較低。見圖3、4。

圖3 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265表達(dá)水平與OS的關(guān)系

圖4 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265表達(dá)水平與DFS的關(guān)系

miR-98-5p高表達(dá)患者OS為31.27個(gè)月（95%CI：28.91，33.64），DFS 為30.56 個(gè)月（95% CI：28.07，33.06）；miR-98-5p 低表達(dá)患者OS 為25.65 個(gè)月（95% CI：22.57，28.73），DFS 為23.01 個(gè)月（95% CI：20.11，26.51）。miR-98-5p 高表達(dá)與低表達(dá)患者的總生存率、無病生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.017 和11.205，均P=0.001），miR-98-5p 高表達(dá)患者總生存率、無病生存率較高。見圖5、6。

圖5 NSCLC患者癌組織miR-98-5p表達(dá)水平與OS的關(guān)系

圖6 NSCLC患者癌組織miR-98-5p表達(dá)水平與DFS的關(guān)系

2.5 NSCLC患者預(yù)后因素的分析

表4 影響NSCLC患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

表5 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

NSCLC 是發(fā)并率和死亡率較高的呼吸系統(tǒng)腫瘤，目前，手術(shù)仍是治療NSCLC 的重要手段，但因手術(shù)的創(chuàng)傷性及術(shù)后的高復(fù)發(fā)率，患者預(yù)后較差[8-9]。因此，尋找與NSCLC 發(fā)病相關(guān)，且可評估患者預(yù)后的指標(biāo)，對及早干預(yù)，改善NSCLC 患者生存狀況有積極意義。

lncRNA 是一類長鏈非編碼RNA，其可調(diào)控炎癥反應(yīng)、染色體重構(gòu)、免疫應(yīng)答、自噬、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖/凋亡、氧化應(yīng)激等過程，與慢性阻塞性肺疾病、肺癌等密切相關(guān)[10-11]。有研究顯示，lncRNA GABPB1-IT1 在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)，其可能是治療NSCLC 的靶點(diǎn)及評估預(yù)后的標(biāo)志物[12]；另外，lncRNA GAS5 在NSCLC 中過表達(dá)，其有望成為診治、評估NSCLC 預(yù)后的有效指標(biāo)[13]。以上研究表明，NSCLC 病理變化可能與lncRNA 表達(dá)失調(diào)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00265 作為lncRNA 成員之一，在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高，其可能通過調(diào)控有關(guān)靶基因的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[14]；另外，lncRNA LINC00265 在AML 患者骨髓及血清中過表達(dá)，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)AML 細(xì)胞增殖、侵襲，具有診斷和評估AML 患者預(yù)后的潛在價(jià)值[15]。以上研究表明，lncRNA LINC00265 可能在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用。 本研究中NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，與其在AML 的趨勢一致[15]，且NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度有關(guān)，提示lncRNA LINC00265 與NSCLC 患者的臨床病理特征相關(guān)，其可能對NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用，推測lncRNA LINC00265 可能通過靶向結(jié)合相關(guān)基因，調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移，抑制癌細(xì)胞凋亡，從而影響NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制有待深入研究。

miRNA 是機(jī)體一類非編碼小RNA 分子，其可調(diào)節(jié)生長發(fā)育、血管生成，影響自噬，調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、遷移、增殖，參與免疫炎癥，介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p 作為miRNA 家族的一員，其可靶向結(jié)合α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)而抑制NSCLC 進(jìn)展[18]；另外，miR-98-5p在NSCLC 中表達(dá)降低，其可能通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進(jìn)而在NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[19]。以上研究證實(shí)，miR-98-5p 可能作為抑癌因子，在NSCLC 病變過程中發(fā)揮抑癌作用。本研究顯示，NSCLC 患者癌組織miR-98-5p 相對表達(dá)量低于癌旁正常組織，與JIANG 等[6]研究結(jié)果一致，且癌組織miR-98-5p 表達(dá)水平與NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度有關(guān)，提示miR-98-5p 可能參與并影響NSCLC 病理變化，推測miR-98-5P 可能通過靶向結(jié)合有關(guān)基因，調(diào)節(jié)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與調(diào)控NSCLC 進(jìn)展，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

此外，生物信息學(xué)分析顯示，miR-98-5p可能是lncRNA LINC00265 的靶基因，且本研究中NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達(dá)水平與miR-98-5p 呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA LINC00265 可能與miR-98-5p 靶向結(jié)合，共同調(diào)控NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展，但其機(jī)制有待深入研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，lncRNA LINC00265 高表達(dá)、miR-98-5p 低表達(dá)患者36 個(gè)月OS 較低，提示lncRNA LINC00265、miR-98-5p 與NSCLC 患者預(yù)后相關(guān)，兩者有望成為評估NSCLC 患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、lncRNA LINC00265是影響NSCLC 患者預(yù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-98-5p 是影響NSCLC 患者預(yù)后死亡的獨(dú)立保護(hù)因素，提示臨床分期越高、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、lncRNA LINC00265 表達(dá)水平升高、miR-98-5p 表達(dá)水平降低均會增加NSCLC 患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)測定肺組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達(dá)量有助于及早診治、評估NSCLC 患者預(yù)后。

綜上所述，NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達(dá)上調(diào)，miR-98-5p 表達(dá)下調(diào)，兩者呈負(fù)相關(guān)，均可能在NSCLC 發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，且兩者可作為評估NSCLC 患者預(yù)后的標(biāo)志物。本研究存在隨訪時(shí)間較短，樣本較少，且未深入探究lncRNA LINC00265、miR-98-5p 在NSCLC的作用機(jī)制，后期仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、延長隨訪時(shí)間，結(jié)合基礎(chǔ)研究，為臨床診治NSCLC 提供新靶點(diǎn)增加說服力。