張強(qiáng) 李恒平 王俊 黃衛(wèi)東 湯建軍

(襄陽市第一人民醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬第四臨床學(xué)院，湖北 襄陽 441000)

胃癌是一種致死率非常高的惡性腫瘤〔1,2〕，有極高的侵襲性〔3,4〕，約有80%的患者在就診時已出現(xiàn)臨近組織的侵襲〔5〕。放療對晚期胃癌有一定的治療效果，可使癌癥細(xì)胞變性壞死并抑制其生長，達(dá)到延長晚期胃癌患者生存的機(jī)會；但是胃癌對以順鉑類藥物為主化療藥物的敏感度較低，目前還沒有公認(rèn)的有較好治療效果的化療方案，綜合治療效果有限。多西紫杉醇是通過對紫杉醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而得到的〔6,7〕。多西紫杉醇通過促進(jìn)微管蛋白二聚體的組合并阻止其解聚而達(dá)到穩(wěn)定微管的作用，從而誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡〔8〕。多西紫杉醇對肺癌、乳腺癌、軟巢癌、結(jié)腸癌等多種小鼠移植人體腫瘤有效〔9〕。若下調(diào)細(xì)胞自噬可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對化療的敏感性，這種化療協(xié)同作用的機(jī)制可能與抑制胃癌細(xì)胞的保護(hù)性自噬，影響溶酶體功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)〔10〕。本研究旨在從誘發(fā)細(xì)胞自噬和凋亡角度探究多西紫杉醇對胃癌細(xì)胞的影響，以探究其可能的作用機(jī)制，為臨床診治提供診治靶點。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞GBC-SD置于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES緩沖液及100 U/ml的青霉素和鏈霉素，于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的GBC-SD細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后離心棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍。腫瘤細(xì)胞傳代4次后收集細(xì)胞，以便后續(xù)檢測。

1.2噻唑藍(lán)(MTT)實驗檢測多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞生長抑制的影響 將處于對數(shù)生長期的胃癌GBC-SD細(xì)胞接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞。貼壁后加入200 μl(濃度分別為4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml)的多西紫杉醇處理6 h，每個濃度設(shè)置3個平行孔，并設(shè)立陰性對照組，對照組添加等量的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT液，37℃孵育箱培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 150 μl，震蕩培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀對其光密度OD值(波長570 nm)進(jìn)行檢測并計算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞抑制率IR=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.3細(xì)胞劃痕實驗檢測多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞遷移能力的影響 將處于對數(shù)生長期的胃癌GBC-SD細(xì)胞接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞。貼壁后用100 μl的微量移液頭在孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS清洗2次。1 h后，加入1 ml濃度分別為16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml的多西紫杉醇，每個濃度設(shè)置3個平行孔，并設(shè)立陰性度照度，對照組加入等量的PBS。鏡下觀察處理0 h、36 h的GBC-SD細(xì)胞遷移變化，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4Transwell細(xì)胞侵襲實驗檢測多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞侵襲能力的影響 取生長對數(shù)期的GBC-SD細(xì)胞，分別加入16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml的多西紫杉醇作用一定時間，胰蛋白酶消化后調(diào)細(xì)胞濃度，各組分別吸取200 μl接種于Transwell上部隔室，將其置于24孔板；下部隔室內(nèi)DMEM培養(yǎng)基中胎牛血清濃度為10%。孵育后取出BioCoat基質(zhì)膠侵襲小室，棄去上部隔室液體。過濾器上表面細(xì)胞用棉棒擦去，下表面細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。鏡下觀察計算不同多西紫杉醇濃度、不同處理時間下侵襲細(xì)胞的平均數(shù)目。

1.5用流式細(xì)胞儀檢測多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響 將處于對數(shù)生長期的胃癌GBC-SD細(xì)胞接種于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約含1×104個細(xì)胞。貼壁后分別加入濃度分別為16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml的多西紫杉醇培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置3個平行孔，并設(shè)立陰性對照組，對照組添加等量的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后，消化收集細(xì)胞。按照KGA107凱基細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，用 PBS對各孔進(jìn)行清洗(1 500 r/min離心5 min)，避光染色20 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6用流式細(xì)胞儀檢測多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞周期分布的影響 細(xì)胞接種、藥物處理同1.5，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化后收集，80%的冰乙醇固定，-20℃保存。之后4℃溫育30 min，用 PBS對各孔進(jìn)行清洗(1 500 r/min離心5 min)，并用PI(含300 μg/ml的RNS酶)重懸沉淀。然后將GBC-SD細(xì)胞冰上孵育30 min，并用尼龍網(wǎng)過濾。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.7Western印跡分析Beclin1、LC3、Akt蛋白表達(dá)變化 配制一定濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將凝膠置于電泳槽上，將各組腫瘤細(xì)胞制備的蛋白上樣并電泳。電泳后轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉清洗后分別加入稀釋過的Beclin1、LC3、Akt蛋白抗體，2℃過夜，TBS-T洗3次，每次5 min；隨后加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃作用2 h，TBS-T洗3次×5 min。設(shè)立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標(biāo)記的IgG為二抗。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2分析。

2 結(jié) 果

2.1多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞生長抑制的影響 不同濃度的多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞均有不同的程度的抑制作用，且隨著多西紫杉醇濃度及作用時間的增大而增強(qiáng)。即多西紫杉醇誘導(dǎo)GBC-SD細(xì)胞死亡呈現(xiàn)藥物濃度和時間依賴關(guān)系(P<0.05)。見表1。

2.2多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞遷移能力的影響 不同濃度的多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞的遷移能力有不同的程度的抑制作用，隨著多西紫杉醇濃度及作用時間的增大抑制作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞侵襲能力的影響 不同濃度的多西紫杉醇可以劑量依賴性的抑制胃癌GBC-SD細(xì)胞的侵襲能力，且隨著作用時間的增長，對細(xì)胞侵襲能力的抑制作用越強(qiáng)，能夠穿過基質(zhì)膠遷移到下部隔室的細(xì)胞數(shù)量越少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度的多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞作用一段時間后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著多西紫杉醇濃度及作用時間的增大，GBC-SD細(xì)胞凋亡增高。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.5多西紫杉醇對胃癌GBC-SD細(xì)胞周期分布的影響 不同藥物濃度的多西紫杉醇處理GBC-SD細(xì)胞24 h后，隨著濃度的增加，處于G2期的腫瘤細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，處于G1期的腫瘤細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 多西紫杉醇處理24 h對胃癌GBC-SD細(xì)胞周期分布的影響

2.6多西紫杉醇誘導(dǎo)前后對Beclin1、LC3及PI3K/Akt蛋白表達(dá)的影響 與多西紫彬醇0 μg/ml組比較，Beclin1、LC3通過32 μg/ml多西紫杉醇誘導(dǎo)后，蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明多西紫杉醇促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬可能與上調(diào)Beclin1、LC3自噬蛋白表達(dá)有關(guān)。PI3K/Akt作為一種重要的調(diào)控自噬信號途徑，在細(xì)胞的增殖、凋亡及周期調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。與多西紫杉醇0 μg/ml組相比，PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6、圖1。

圖1 多西紫杉醇對Beclin1、LC3及PI3K/Akt蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃癌發(fā)病隱匿，早期診斷率極低〔11，12〕。目前對于胃癌發(fā)病原因及綜合治療等方面并沒有突破性進(jìn)展。胃癌的治療以順鉑類化療藥物為主，但癌細(xì)胞對其敏感度較低〔13～15〕，目前暫無公認(rèn)較好治療效果的化療方案，綜合治療效果有限，亟需開發(fā)新的更高效的化療藥物及治療方案。

多西紫杉醇結(jié)構(gòu)特點與紫杉醇相似，其不同點僅在于紫杉醇母核C 10上的乙酰氧基被羥基取代，及C 13側(cè)鏈N上的苯甲酰基被叔丁氧羰基取代〔16〕。多西紫杉醇為細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，特異性作用于M期細(xì)胞〔17〕。其可促進(jìn)小管聚合成為穩(wěn)定的微管，抑制其解聚，還破壞微管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞有絲分裂〔18，19〕。多西紫杉醇作為一種新型的廣譜抗腫瘤藥物，其抗癌活性是紫杉醇的10倍。體外研究表明，多西紫杉醇誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期分布〔20〕。其作用機(jī)制可能為多西紫杉醇可通過與β-微管蛋白N末端結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白聚合，阻止微管解聚；最終通過抑制癌細(xì)胞的有絲分裂而達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的〔21，22〕。即多西紫杉醇促進(jìn)微管蛋白聚合，形成穩(wěn)定的微管，同時抑制微管解聚，從而形成穩(wěn)定的微管束，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂不可以進(jìn)行，將增殖期的腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，細(xì)胞生長受到抑制。多西紫杉醇作用后胃癌細(xì)胞有一定比率的凋亡現(xiàn)象發(fā)生。凋亡是細(xì)胞主動的自殺現(xiàn)象。多西紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是將細(xì)胞阻滯在特定細(xì)胞周期后啟動凋亡程序。紫杉醇類阻滯腫瘤細(xì)胞的有絲分裂對于誘導(dǎo)凋亡十分重要，其對有絲分裂的阻滯與凋亡現(xiàn)象關(guān)系密切。本研究結(jié)果證實多西紫杉醇能夠抑制GBC-SD細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且呈時間和劑量依賴性。自噬的實質(zhì)是細(xì)胞借助溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，實現(xiàn)細(xì)胞本身代謝和某些細(xì)胞器更新的過程〔19〕。自噬在基體的生理和病理過程中都能見到，并且在腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

Beclin1是酵母中Atg6的哺乳動物同源基因，能夠自定位到自噬前體結(jié)構(gòu)中，其主要通過與磷酸肌醇三磷酸激酶Ⅲ型PIK形成復(fù)合體通過調(diào)控其它自噬蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)對自噬活性的調(diào)控。研究表明，Beclin1在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出單個基因缺失和低水平表達(dá)，而細(xì)胞自噬與Beclin1的高表達(dá)密切相關(guān)〔23，24〕。LC3是酵母中Atg8的哺乳動物同源基因，可分為非活化的LC3-1和活化的LC3-2兩型，對自噬泡的形成必不可少。LC3參與兩個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的加工修飾過程：LC3前體加工成胞漿可溶形式的LC3-1，在Atg4、Atg7參與下，活化的LC3-1被轉(zhuǎn)運至Atg3并與磷脂酰乙醇胺PE結(jié)合形成LC3-2。LC3-2在Atg5的協(xié)助作用下與前自噬泡和自噬泡膜相結(jié)合，最終被溶酶體酶降解〔25〕，因此LC3-2可作為自噬活動的特異性標(biāo)志物。調(diào)控自噬信號的途徑有多種，研究表明PI3K-Akt途徑在腫瘤細(xì)胞自噬調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。

本研究新穎之處在于本研究探明了多西紫杉醇對GBC-SD細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲呈劑量和時間依賴性，并可將細(xì)胞阻滯于M期，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Beclin1、LC3自噬蛋白表達(dá)和抑制PI3K-Akt自噬負(fù)調(diào)控信號轉(zhuǎn)換有關(guān)。本研究的不足及局限性在于多西紫杉醇誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性凋亡的分子機(jī)制和上下游信號通路尚不清楚，這也我們下一步研究的方向。