葉茂斌 肖明躍 陳妍林 熊維 經屏

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院神經內科，湖北 武漢 430000)

帕金森病(PD)是一種以運動功能障礙為特征的進行性神經系統(tǒng)疾病，現已成為第二常見的慢性和全身性神經退行性疾病，僅次于阿爾茨海默病(AD)〔1〕。據估計，每年每1 010 000人中將出現約8～18例新診斷的PD病例〔2〕。PD的特征是黑質致密部(SNpc)中多巴胺能(DA)神經元的特異性丟失及伴隨著廣泛的細胞內α-突觸核蛋白(syn)聚集體，進而觸發(fā)異常的神經信號，導致運動協(xié)調障礙和認知缺陷〔3〕。目前治療PD的方法主要是緩解癥狀，而不是抑制PD的發(fā)展。近年來，非編碼RNA(ncRNA)，特別是長鏈非編碼RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)在腦發(fā)育和分化等細胞過程及PD和AD等疾病中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用〔4〕。LncRNA是一類長度超過200個核苷酸且無蛋白質編碼能力的ncRNA〔5〕。研究表明，LncRNAs在大腦中經常被上調，并參與許多神經生物學功能和神經退行性疾病〔6〕，其中母細胞表達基因(MEG)3可通過靶向miR-147增強PC12細胞缺氧損傷〔7〕，β淀粉樣肽1～42可通過促進MEG3表達誘導SH-SY5Y細胞凋亡〔8〕。然而，MEG3在PD中的確切作用仍不清楚。本研究將探究LncRNA MEG3在MPP+誘導的PD細胞模型中的表達及其對細胞模型損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；視黃酸購自美國Sigma公司；LncRNA MEG3引物、β-actin引物、LncRNA MEG3 siRNA均及其對照siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Trizol、Lipofectamine2000均購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；2×SYBR Green RT-PCR混合物購自南京諾唯贊生物有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、細胞凋亡試劑盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司；Notch 1、Hes 1和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗購自美國Abcam公司，電化學發(fā)光(ECL)液購自德國Merck公司。

1.2細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清和10 μmol/L新鮮視黃酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。第7天時，SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。用不同濃度(0.00、0.25、0.50和1.00 mmol/L)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)處理SH-SY5Y細胞24 h或用0.50 mmol/L MPP+處理不同時間(0、12、24和48 h)來構建PD細胞模型。

1.3細胞處理 取對數生長期SH-SY5Y細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達80%時，用或不用0.50 mmol/L MPP+處理細胞24 h，分別記為MPP+組和陰性對照組。用Lipofectmine2000轉染試劑將陰性對照siRNA、LncRNA MEG3 siRNA轉入細胞中，分別記為沉默對照組、沉默MEG3組，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后進行后續(xù)實驗研究。

1.4RT-PCR檢測 利用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒進行反轉錄，檢測各組細胞LncRNA MEG3表達，以β-actin為內參。LncRNA MEG3正向引物：5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反向引物:5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGG GGCT-3′；β-actin正向引物：5′-ACCACCTTCAACTCCATCATG-3′，反向引物5′-CTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′。

1.5細胞活力檢測 取對數生長期細胞分別接種于96孔板中，每孔接種5 000個，每組設3個復孔，待細胞貼壁后加入0.50 mmol/L MPP+處理24 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，用酶標儀震蕩10 min以溶解結晶并檢測490 nm處各孔吸光值。細胞活力(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/樣品對照孔吸光度×100。

1.6LDH檢測 取5 000個對數生長期細胞接種于96孔板中，每組設3個復孔，待細胞貼壁后加入0.5 mmol/L MPP+處理24 h，將上清液用反應混合物(含有催化劑和染料溶液)處理，并在室溫下在黑暗中溫育30 min，使用酶標儀讀板儀檢測490 nm處各樣本吸光值。LDH釋放(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/樣品對照孔吸光度×100。

1.7細胞凋亡檢測 用胰蛋白酶消化細胞并轉移到收集管中，以1 000 r/min離心5 min使細胞沉淀，離心半徑5 cm，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞并計數，取(5～10)萬重選細胞轉移至新的1.5 ml管中，并通過離心再次沉淀，加入195 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min使細胞沉淀，棄去上清液，加入190 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10 μl PI染色液，輕輕混勻，冰上放置10 min，流式細胞儀進行檢測。

1.8Western印跡檢測 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經高溫變性后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫孵育2 h，分別用Notch 1、Hes 1和GAPDH一抗稀釋液與4℃孵育相應的蛋白條帶過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，適量HRP耦聯(lián)的二抗稀釋液室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液于凝膠成像儀上進行曝光顯影，Image J軟件分析Notch 1和Hes 1蛋白條帶的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA MEG3在MPP+處理的SH-SY5Y細胞中表達增加 不同濃度MPP+(0.25、0.50、1.00 mmol/L)處理24 h后SH-SY5Y細胞中LncRNA MEG3表達(1.89±0.20、2.78±0.29、2.85±0.29)均顯著高于陰性對照組(1.01±0.10，F=41.299，P<0.001)；0.50 mmol/L MPP+處理不同時間(12、24、48 h)后SH-SY5Y細胞中LncRNA MEG3表達(1.72±0.18、2.82±0.29、2.96±0.31)均顯著高于陰性對照組(0.98±0.09，F=48.123，P<0.001)。

2.2抑制SH-SY5Y細胞中LncRNA MEG3表達 沉默MEG3組SH-SY5Y細胞中LncRNA MEG3表達水平(0.17±0.02)顯著低于沉默對照組(1.02±0.11，t=13.170，P=0.004)。

2.3沉默LncRNA MEG3抑制MPP+誘導的細胞損傷 MPP+組細胞活力較陰性對照組顯著降低，而沉默MEG3組細胞活力較沉默對照組顯著增加(均P<0.05)。與陰性對照組比較，MPP+組LDH釋放量顯著增加，而沉默MEG3組LDH釋放量較沉默對照組顯著降低(均P<0.05)。見表1。

表1 沉默LncRNA MEG3對MPP+誘導的細胞活力和LDH釋放的影響

2.4沉默LncRNA MEG3抑制MPP+誘導的細胞凋亡 與陰性對照組凋亡率〔(4.12±0.83)%〕比較，MPP+組凋亡率〔(23.41±2.52)%〕明顯增加(t=12.593，P=0.003)，而沉默MEG3組細胞凋亡率〔(8.13±1.16)%〕較沉默對照組〔(21.76±1.95)%〕顯著降低(t=10.405，P=0.001)。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測SH-SY5Y細胞凋亡

2.5沉默LncRNA MEG3抑制Notch信號通路蛋白表達 MPP+組Notch 1(1.21±0.12)和Hes 1(0.75±0.08)蛋白表達較陰性對照組(0.36±0.04、0.28±0.03)均明顯增加(t=11.639、9.528，P<0.05)，而沉默MEG3組Notch 1(0.38±0.04)和Hes 1(0.26±0.03)蛋白表達較沉默對照組(1.15±0.12、0.78±0.08)顯著降低(t=10.544、10.542，P<0.05)。見圖2。

1～4：陰性對照組；MPP+組；沉默對照組；沉默MEG3組圖2 Western印跡檢測SH-SY5Y細胞中Notch信號通路蛋白表達

3 討 論

DNA元件百科全書項目的最新數據表明，70%以上的人類基因組產生初級轉錄本，而蛋白質編碼基因在初級轉錄本中僅占2.94%，而其余轉錄本則被認為是ncRNA〔9〕。根據核苷酸長度，ncRNA一般分為兩類，小于200個核苷酸的通常稱為短/小ncRNA，包括miRNA，而大于200個堿基的則稱為LncRNA〔10〕。然而LncRNA缺乏蛋白質編碼能力，其潛在功能可能通過多種機制在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因表達〔11〕。LncRNA的異常表達，如BC200、NEAT1和DISC2等，被認為與AD、亨廷頓病(HD)和精神分裂癥等神經系統(tǒng)疾病密切相關〔12～14〕。最近研究表明，包括naPINK1和ASUchl1在內的幾種LncRNA在PD發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用〔15,16〕。Liu等〔17〕發(fā)現LncRNA同源盒轉錄本反義RNA(HOTAIR)在MPTP誘導的PD小鼠中腦組織和MPP+預處理的SH-SY5Y細胞中高表達，并通過調節(jié)亮氨酸-富重復激酶(LPPK)2促進MPTP誘導的PD的發(fā)生。LncRNA MEG3作為競爭性內源性RNA可通過miR-181b/12/15-LOX信號通路調節(jié)缺氧誘導的神經細胞損傷〔18〕。

據報道，Notch信號在多個生物學過程中起著關鍵作用，包括個體發(fā)育過程、細胞增殖、分化和細胞命運決定〔19〕。Notch 1是Notch信號傳導的主要組成部分，是一種跨膜蛋白，廣泛分布于許多組織中。配體結合后，Notch 1被激活并調節(jié)靶基因Hes 1的表達。據報道，Notch信號對中樞神經系統(tǒng)疾病的病理過程很重要，并且參與了多種衰老疾病過程，例如AD〔20〕。此外，蛇床子素還可通過Notch信號通路改善小鼠急性機械性腦損傷的神經功能〔21〕。

綜上，本研究發(fā)現LncRNA MEG3在MPP+誘導的PD細胞損傷模型中表達上調，沉默LncRNA MEG3可通過抑制Notch信號通路減輕MPP+誘導的PD細胞模型損傷，提示LncRNA MEG3可能是PD診斷治療的潛在靶點。