閆磊 周宏博 崔紅 梁軍 孫曉冬 朱梅 佟雷

(牡丹江醫(yī)學院 1組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011；2紅旗醫(yī)院；3干細胞研究所；4藥劑學教研室)

膠質(zhì)細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、對放療和化療抵抗并容易復發(fā)等特點〔1〕。新的治療方式例如中藥聯(lián)合腫瘤抑制基因治療越來越被關注。Rab23屬于小GTP 酶，是Ras致癌基因家族的一名成員，位于染色體 6p12.1，最早是1994年從小鼠腦部分離得到，Rab23基因在肝癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用〔2〕。人參皂甙Rg3是人參二醇類四環(huán)三萜皂甙，具有顯著的抗腫瘤作用〔3〕。本實驗選取膠質(zhì)瘤U251細胞為實驗對象，探討Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對U251細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 細胞 膠質(zhì)瘤細胞系U251，購自美國ATCC公司。試劑Rab23質(zhì)粒，購自中國質(zhì)粒載體細胞基因保藏中心；人參皂甙Rg3(純度99%)，購自天津馬克生物有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自美國Sigma公司；反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；儀器5417R臺式高速離心機購自德國Ep-pendorf生命科學有限公司產(chǎn)品；JYH27020電泳儀購自美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品；ELX800酶標儀購自美國Bio-Tek儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1U251細胞培養(yǎng)與轉染〔4〕將U251細胞培養(yǎng)至含10%胎牛血清、含100 U/L青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶傳代1次。將U251細胞以2.5×104個/ml的密度接種在鋪有蓋玻片的24孔板中。細胞80%融合后，按說明書操作轉染細胞，質(zhì)粒終濃度：25 mol/L。6 h后終止轉染，用含10%小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2分組與給藥方法〔4〕將膠質(zhì)瘤U251細胞分為4組，空白對照組，Rab23轉染組，人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組。Rab23轉染組用脂質(zhì)體轉染Rab23質(zhì)粒過表達Rab23。人參皂甙Rg3組給予25 mg/L人參皂甙Rg3處理，Rab23+人參皂甙Rg3組給予轉染Rab23質(zhì)粒和25 mg/L人參皂甙Rg3處理。

1.2.3Western印跡檢測Rab23蛋白的表達〔5〕用RIPA細胞解液提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，各取40 μg取蛋白行Western印跡檢測。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉膜印跡，經(jīng)封閉液4℃作用過夜后，用鼠抗人Rab23抗體(稀釋度為1∶1 000)或GAPDH抗體與膜上的抗原結合。用辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)與其反應后室溫孵育2 h，用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯色，經(jīng)壓片曝光后，顯影定影。采用 Quantity One 軟件分析目的Rab23蛋白/GAPDH的灰度值進行統(tǒng)計分析，進行掃描采圖與分析。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測Rab23mRNA的表達〔5〕根據(jù)Genebank的β-actin和Rab23的序列，利用Premier5.0軟件設計可擴增的產(chǎn)物，引物序列：β-actin上游引物為5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′，下游引物為5′-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3′，擴增序列長度為182 bp。Rab23上游引物為5′-AGGCACTGGCAAAAAGGTTA-3′，下游引物為5′-CGGAGTGACTTCCACCAGAT-3′，擴增序列長度為198 bp。轉染后48 h收集各實驗組細胞1×107個，按Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA濃度及純度備用，合成cDNA按常規(guī)行RT-PCR，反應體系：SYBR Premix ExTaqTMⅡ(2×)12.5 μl，cDNA 模板2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，dH2O 8.5 μl。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10 min。重復實驗3次。Rab23 mRNA相對含量測定：用凝聚膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描并用Quantity One軟件計算Rab23mRNA/β-actin的比值，從而得出Rab23 mRNA的相對含量。

1.2.5MTT比色法檢測U251細胞增殖抑制水平〔2〕將空白對照組和Rab23轉染組細胞按1×107個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板上，體積100 μl/孔，每組設5個復孔。細胞80%融合后，分別向Rab23轉染組，人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組加入25 mg/L人參皂甙Rg3，細胞接種48 h后，取96孔板行MTT檢測。每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光培育，4 h棄孔內(nèi)上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結晶，酶標儀上490 nm波長下測其吸光度值(A)。

1.2.6Western印跡檢測增殖細胞核抗原Ki-67(Ki-67)和B細胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白的表達〔6，7〕細胞分組同1.2.2。給藥48 h后，按照文獻方法檢測U251細胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的相對表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1U251細胞中Rab23 蛋白的表達 空白對照組(0.91±0.24)凝膠成像及分析系統(tǒng)對樣本的條帶灰度值與相尖β-antin條帶灰度值比值明顯低于Rab23轉染組(1.23±0.17)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 U251細胞中Rab23蛋白的表達

2.2U251細胞中Rab23 mRNA的表達 空白對照組Rab23 mRNA灰度比值(0.83±0.12)明顯低于Rab23轉染組(1.69±0.37，P<0.01)。

2.3各組U251細胞的增殖水平 空白對照組、Rab23轉染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3組在第48小時吸光度A490值分別為0.87±0.08，0.61±0.06，0.49±0.11，0.35±0.03。與空白對照組比較，Rab23轉染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3的增殖水平明顯依次降低，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Rab23+人參皂甙Rg3組作用最為顯著，表明Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖水平有明顯協(xié)同抑制作用。

2.4U251細胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的表達 與空白對照組比較，Rab23轉染組、人參皂甙Rg3組和Rab23+人參皂甙Rg3的Ki-67蛋白表達水平明顯依次降低，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Rab23+人參皂甙Rg3組作用最為顯著，Bcl-2蛋白表達亦有同樣趨勢，表明Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對膠質(zhì)瘤U251細胞的Ki-67和Bcl-2表達水平有明顯協(xié)同抑制作用，見表1。

表1 各組U251細胞Ki-67和Bcl-2蛋白表達

3 討 論

膠質(zhì)瘤治療以手術為首選，但由于膠質(zhì)瘤具有浸潤生長的特性，與腦組織間無明顯邊界，難以全部切除。探索新的治療方法抑制膠質(zhì)瘤已經(jīng)成為醫(yī)學的研究熱點。腫瘤抑制基因聯(lián)合中藥治療將具有非常好的前景。

Rab23基因編碼的蛋白是小GTP 酶超家族Rab家族成員，Rab23在成年小鼠的腦、乳腺、胃、精巢、卵巢等組織中也有表達，提示Rab23在成體組織器官功能的維持過程中起重要作用〔8〕。同時，Rab23還介導了細胞內(nèi)小泡的運輸及溶酶體的內(nèi)吞作用〔9〕。Hedgehog信號轉導通路是一個經(jīng)典的控制胚胎發(fā)育的信號轉導途徑，主要由3種分泌型糖蛋白配體Shh、Ihh 和Dhh，兩個跨膜蛋白受體Ptch1、Smo，3個核轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3及下游的靶基因等組成。在Hedgehog信號通路中，多種基因已經(jīng)被鑒定為原癌基因或腫瘤抑制基因。Rab23可以通過調(diào)控轉錄因子Gli2和Gli3的活性或改變Smo與Gli之間關鍵因子的亞細胞定位，抑制Hedgehog信號通路的激活。Rab23可能是Hedgehog信號通路的負調(diào)節(jié)分子并成為Hedgehog信號轉導途徑調(diào)控中具有抑制腫瘤的作用的一個新靶點〔8～10〕。人參皂苷Rg3是由人參中提取的天然活性成分，具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移、逆轉耐藥，與化療聯(lián)合協(xié)同增效等顯著的作用〔11，12〕。

增殖細胞核抗原Ki-67是細胞作為細胞周期中核抗原的決定簇，在細胞周期中處于活動期的細胞均可表達，在腫瘤細胞中廣泛應用作為處于增殖狀態(tài)的標志物〔13〕。Bcl-2能夠抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，屬于抗凋亡基因〔14〕。

綜上，Rab23基因聯(lián)合人參皂甙Rg3對膠質(zhì)瘤U251細胞有抑制增殖和促進凋亡作用，并且聯(lián)合作用比單獨使用效果更加明顯。腫瘤增殖是腫瘤患者致死的最直接原因。腫瘤抑制基因和中藥聯(lián)合治療可能發(fā)揮較好作用，這為膠質(zhì)瘤的治療提供了一個新的方向。