行書麗 董永書 (河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州 450000； 河南省中醫(yī)藥研究院)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已成為死亡率最高的惡性腫瘤之一。早期診斷并阻止其侵襲轉(zhuǎn)移是目前研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常是惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的普遍特征，故細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)對腫瘤細(xì)胞黏附、遷移、侵襲很重要。β1,3-N乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅷ(β3GnT8) 是從人肺cDNA文庫中克隆到的糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)新成員〔1〕，該基因在多種腫瘤細(xì)胞株中β3GnT8都有不同程度表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)它與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔2,3〕。目前該基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移報(bào)道較少，本文將β3GnT8的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞，特異性地抑制β3GnT8基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)，來探討β3GnT8對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；Trizol購自Ambion公司；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒購自Vazyme公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司；CD147一抗購自Boster公司，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2一抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物液購自Thermo旗下Nun公司；顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠。

1.2方法

1.2.1A549細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將在液氮中保存的A549細(xì)胞取出復(fù)蘇，于37℃、 5%CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞的密度達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞相互分離變圓即消化完成，快速棄去胰酶，加入完全培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1∶4的比例傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)培養(yǎng)期的細(xì)胞接種至六孔板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋達(dá)到80%，將β3GnT8真核反義重組載體pEGFP-C1-β3GnT8-AntiSense及空載體 pEGFP-C1通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h檢測各項(xiàng)指標(biāo)。將轉(zhuǎn)染反義表達(dá)載體的細(xì)胞命名為A549-AS組，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞命名為A549-0組，未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞即為A549組。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測β3GnT8 mRNA的表達(dá) 收集3組細(xì)胞(A549組、A549-0組及A549-AS組)，用Trizol法提取RNA，于空氣中干燥RNA沉淀8 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。溶解后的RNA取2 μl用分光光度法測定OD260和OD280，計(jì)算RNA的純度和濃度。OD260/OD28比值在1.8～2.0滿足實(shí)驗(yàn)要求。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR反應(yīng)的模板。

將cDNA8倍稀釋，構(gòu)建20 μl的反應(yīng)體系，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。β3GnT8上游引物為5′-GCTGCCCTTTGCTTACTG-3′，下游引物為5′-GCCCTGGTTCTGACTTGA-3′。最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.2.4Western印跡檢測β3GnT8、CD147、MMP2蛋白水平的表達(dá) 3組細(xì)胞用6孔細(xì)胞板培養(yǎng)，吸掉培養(yǎng)上清后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，每孔加入100 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，冰上裂解30 min，搖動(dòng)細(xì)胞板使細(xì)胞充分裂解，收集至EP管中離心，收集上清，蛋白定量、變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，用含5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h,用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,使聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。用Band Scan分析膠片灰度值。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測β3GnT8對細(xì)胞遷移能力的影響 取對數(shù)生長期的3組細(xì)胞(A549、A549-0及A549-AS)，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml接種于6孔板，37℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞融合鋪滿6孔板底部，用槍頭劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，同時(shí)拍取0 h照片，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h拍照，在劃痕處拍照記錄遷移結(jié)果。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度) /0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞黏附能力檢測 將纖維連接蛋白使用超純水配成1 mg/ml母液，10倍稀釋成100 μg/ml，96孔板每孔加入100 μl稀釋好的纖維連接蛋白溶液，封口膜封口后，冰箱4℃包被過夜，吸出纖維連接蛋白包被液，PBS清洗2次備用。取處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，分別調(diào)整3組細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，加至包被好的細(xì)胞培養(yǎng)板，低速離心培養(yǎng)板2 min，使細(xì)胞沉降于培養(yǎng)板底部，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，吸棄未黏附的細(xì)胞，用PBS 洗2次，多設(shè)置1組正常細(xì)胞作為總細(xì)胞組，該組不吸棄細(xì)胞。每孔加100 μl培養(yǎng)基，取1個(gè)高倍鏡(×20)視野拍照。每孔加入10 μl四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD568。黏附百分比=各組吸光值/總細(xì)胞組吸光值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7穿膜實(shí)驗(yàn) 用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋各組細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/ml，備用。用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/ml，在Transwell小室上室底部加入100 μl Matrigel，37℃溫育4 h使其干成膠狀，在24孔板中加入4℃預(yù)冷過的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并放入Transwell小室，在Transwell上室分別接入200 μl各組細(xì)胞懸液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS小心清洗小室1遍，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h，用0.5%結(jié)晶紫染液染色，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞β3GnT8 mRNA表達(dá)水平比較 A549-AS組β3GnT8 mRNA表達(dá)水平(0.316±0.048)顯著低于A549組(1.000±0.000)和A549-0組(0.909±0.037，均P<0.05)。

2.2Western印跡檢測β3GnT8蛋白表達(dá)水平比較 A549-AS組β3GnT8的蛋白表達(dá)水平顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測β3GnT8蛋白

表1 3組β3GnT8、CD147、MMP-2蛋白相對表達(dá)量

2.3β3GnT8對A549細(xì)胞遷移能力的影響 A549-AS組細(xì)胞遷移率〔(38.47±3.88)%〕顯著低于A549組〔(66.32±4.17)%〕和A549-0組〔(63.28±3.98)%，均P<0.05〕。

2.4β3GnT8對A549細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響 A549-AS組對纖維連接蛋白的黏附百分比及侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見表2。

表2 β3GnT8對細(xì)胞黏附及侵襲的影響

2.5β3GnT8對MMP-2、CD147表達(dá)的影響 A549-AS組CD147、MMP-2水平顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測β3GnT8對MMP-2、CD147蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

糖基轉(zhuǎn)移酶可催化活性糖轉(zhuǎn)移到不同的受體分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)，形成糖脂、糖蛋白。細(xì)胞癌變過程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變,糖鏈結(jié)構(gòu)改變主要反映在細(xì)胞表面糖復(fù)合物上,也可反映在分泌的糖復(fù)合物中。糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)異常可能會(huì)引起糖鏈結(jié)構(gòu)的改變或糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)異常，而蛋白質(zhì)糖基化改變與細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)密切關(guān)聯(lián)，如對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生較大影響。研究發(fā)現(xiàn)在垂體腺瘤中β3GnT8的表達(dá)增加,垂體腺瘤的侵襲性增強(qiáng)〔4〕；β3GnT8在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),且促進(jìn)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移〔5〕。

在腫瘤細(xì)胞的浸潤性生長過程中,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 的降解為腫瘤細(xì)胞的遷移提供了足夠的空間。蛋白水解酶MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。其中MMP-2的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的高侵襲能力呈正相關(guān),楊萬廣等〔6〕研究發(fā)現(xiàn),MMP-2在結(jié)腸癌組織中呈顯著高表達(dá),由此推測MMP-2的高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的高轉(zhuǎn)移特性有關(guān)。CD147是一種高度糖基化的細(xì)胞跨膜蛋白，在許多腫瘤細(xì)胞中常高度表達(dá)，本研究結(jié)果表明肺腺癌A549細(xì)胞β3GnT8和MMP-2、CD147的表達(dá)呈正相關(guān)。有研究報(bào)道,β3GnT8在喉癌細(xì)胞中高表達(dá),且通過改變MMP-2/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-2比值影響癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔7〕；β3GnT8通過CD147/MMP-2/Gallectin3軸促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移〔8〕;肝癌的發(fā)生發(fā)展中，其侵襲轉(zhuǎn)移與β3GnT8通過c-Jun依賴的方式調(diào)控HG-CD147的糖基化有關(guān)〔9〕;β3GnT8可通過調(diào)控HG-CD147的糖基化過程促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移〔10〕。這些結(jié)果對我們進(jìn)一步分析β3GnT8促進(jìn)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供一定的思路。本研究推測β3GnT8可能通過影響CD147、MMP-2的表達(dá)來影響A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析研究。