呂俊慧 于佳寧 陳露 宋漢娜 林海燕

(濱州醫(yī)學(xué)院 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東 煙臺 264003；2煙臺附屬醫(yī)院兩腺外科)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是胃黏膜萎縮變化，內(nèi)分泌腺減少或消失。其病程長，難以治愈，通常伴或不伴纖維替換性腸上皮化生和(或)假性幽門上皮化生〔1〕。臨床癥狀是胃部飽脹感、胃痛、反酸、胃灼熱，尤其飯后明顯。長期反復(fù)發(fā)作，極易導(dǎo)致癌變，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。胃癌對于消化道黏膜的傷害是不可逆的，且易轉(zhuǎn)移，其治療過程艱難；但CAG是可逆的，確診和治愈也更為簡便。所以對于CAG癌前病變的研究尤為重要。目前，CAG的病機(jī)尚不清楚，亦沒有療效較好的藥物。臨床上西醫(yī)主要是對癥治療，但是治標(biāo)不治本。而中醫(yī)藥應(yīng)用時間久，累積了豐富的案例經(jīng)驗(yàn)，在臨床中有獨(dú)特的優(yōu)勢。目前，大多中醫(yī)認(rèn)為CAG的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，本研究從脾胃虛證，瘀血阻絡(luò)的方向出發(fā)，以益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)法為主組方，對萎胃康進(jìn)行研究。萎胃康對CAG有較好的治療作用，且優(yōu)于維酶素〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)該藥能有效改善CAG大鼠胃黏膜腺體萎縮，改善胃腸激素對胃功能的調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以防止癌變〔3〕。本研究復(fù)制CAG大鼠模型，通過檢測各組大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α及β-catenin的含量，探討萎胃康顆粒治療CAG的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動物健康，雄性，SD大鼠60只，體重(120±20)g，山東濟(jì)南朋悅繁育有限公司提供。單位許可證編號：SYXK(魯)20140007。藥品與試劑萎胃康顆粒(西洋參、白術(shù)、白芍、延胡索、三七和熊膽等)由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科完成鑒定及制備。水楊酸鈉(批號：20181107)購自北京Solarbio；維酶素片(批號：20170215)購自新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司；兔抗β-catenin(批號:00051773)購自美國proteintech公司；兔抗wnt3α(批號:9G122B)、兔抗wnt5α(批號:ZP480BP80)及兔Ig-G免疫組化試劑盒(批號:13G24C26G0922)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法 動物造模、分組隨機(jī)從60只雄性SD大鼠中抽取10只作為正常組，其他作為造模組。按照傳統(tǒng)方式復(fù)制模型〔4〕：用2%的水楊酸鈉溶液，2 ml/d灌胃，灌胃前后1 h禁食禁水，前3 w正常飲食，后3 w間日足量飲食，進(jìn)行6 w。然后隨機(jī)從正常組抽取2只，造模組抽取5只，肉眼觀察，模型組比正常組大鼠相比，體型瘦小，毛色粗糙晦暗。HE染色，光鏡下觀察到胃黏膜腺體萎縮減少，排列松散，有炎性細(xì)胞浸潤。確認(rèn)造模成功后，將剩余45只模型大鼠隨機(jī)分為萎胃康高〔3.00 g/(kg·d)〕、中〔1.50 g/(kg·d)〕、低〔0.75 g/(kg·d)〕劑量組、維酶素組〔0.3 g/(kg·d)〕、模型組，每組9只，模型組和正常組均灌生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃30 d。組織形態(tài)學(xué)觀察30 d后，禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)，麻醉后固定解剖，把整個胃取出，肉眼觀察整個胃部的變化，然后順著胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗。留取胃竇部，剪為合適的大小，用中性甲醛固定液(10%)固定12 h以上。流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，然后以4 μm的厚度進(jìn)行連續(xù)切片4張，1張做蘇木素-伊紅(HE)染色，其余3張用于免疫組化檢測。指標(biāo)檢測采用免疫組化法(IHC)，嚴(yán)格按照wnt3α、wnt5α和β-catenin抗體試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后抗體在組織中的表達(dá)呈黃褐色，在高倍鏡下隨機(jī)取5個視野拍照后，用Image-Pro Plus6.0圖片分析軟件測積分光密度(IOD)，5個視野的平均IOD即為該大鼠胃組織相應(yīng)指標(biāo)的測定值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1光鏡下各組大鼠胃黏膜的病理變化 正常組胃黏膜腺體排列緊密有序，無或有少量炎性細(xì)胞。模型組胃黏膜變薄，腺體萎縮減少，排列松散，有炎性細(xì)胞浸潤。萎胃康高劑量治療30 d后，胃黏膜腺體萎縮情況緩解，排列稍微整齊，腺體數(shù)目增多，接近正常胃黏膜。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理情況(HE，×20)

2.2各組大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的表達(dá) 與正常組比較，模型組wnt3α、wnt5α和β-catenin表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，各給藥組wnt3α、wnt5α和β-catenin表達(dá)均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。說明萎胃康和維酶素都能降低胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的蛋白表達(dá)量，且萎胃康高劑量組的治療效果比其他給藥組更顯著(P<0.05)。見表1、圖2～4。

圖2 各組大鼠胃黏膜wnt3α蛋白的表達(dá)(DAB,×40)

圖3 各組大鼠胃黏膜wnt5α蛋白的表達(dá)(DAB,×40)

圖4 各組大鼠胃黏膜β-catenin蛋白的表達(dá)(DAB，×40)

3 討 論

CAG屬于中醫(yī)學(xué) “胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。目前，大多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為，CAG的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛是氣陰兩虛，標(biāo)實(shí)是瘀血阻絡(luò)，兩者之間關(guān)系密切，氣陰不足，動力不足，運(yùn)化失常，則脾胃腐熟水谷的能力下降；推動無力，血流不暢，則形成血瘀；瘀血阻絡(luò)，則氣血通行不暢，運(yùn)化失常，導(dǎo)致脾氣胃氣升降失司；兩者互成因果，互相影響。有瘀血阻滯脾胃，氣血不通暢，不通則痛，就出現(xiàn)胃脘痛；脾胃氣行不暢，氣機(jī)升降失常則痞滿；胃氣虛，陰液不足，胃失于濡養(yǎng)，則嘈雜。萎胃康顆粒由西洋參、白術(shù)、白芍、延胡索、三七和熊膽等藥物組成，有補(bǔ)氣健脾、養(yǎng)陰益胃、活血化瘀的作用。其中，西洋參是君藥，能益氣生津、滋養(yǎng)胃陰，具有促進(jìn)免疫力的功能。白術(shù)補(bǔ)脾益氣，具有增強(qiáng)免疫的作用，白芍滋陰，對細(xì)胞免疫功能有正向作用，能抑制急性炎癥水腫，共為臣藥。延胡索用于全身各部氣滯血瘀，能行氣活血，散瘀止痛，三七活血化瘀，熊膽清熱利濕，三者是為佐使藥；另外，延胡索還能起到抗?jié)兊淖饔?，三七具有抗炎的作用，熊膽能抑菌抗炎助消化?/p>

CAG作為胃癌的癌前狀態(tài)，其發(fā)展演變影響人們的健康和生活，CAG的研究對于降低胃癌的發(fā)生有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，wnt信號通路的異常激活在胃癌中是一個普遍事件〔5,6〕。wnt蛋白家族通常是激活是Wnt信號通路的啟動因子〔7〕。經(jīng)典的wnt信號通路主要與β-catenin有關(guān)：β-catenin是一種多功能的蛋白質(zhì)，能夠影響細(xì)胞的生存、凋亡。正常情況下，β-連環(huán)蛋白發(fā)生磷酸化，不會積聚在細(xì)胞內(nèi)〔8〕。當(dāng)wnt信號進(jìn)入細(xì)胞將Dsh激活后，活化的Dsh就會抑制腫瘤抑制基因(APC)、軸蛋白(Axin)和糖原合成酶激酶3β形成的復(fù)合物活性，因此，β-連環(huán)蛋白不能被磷酸化降解，大量累積在細(xì)胞內(nèi)，激活TCF/LEF并調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)〔9〕。由此可見，wnt信號通路的激活與β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)累積的量有關(guān)，β-連環(huán)蛋白是胃癌病變中一個重要的蛋白指標(biāo)。wnt3α目前研究比較多，普遍認(rèn)為它能夠激活wnt經(jīng)典信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，wnt3α表達(dá)量的上調(diào)在激活wnt信號通路導(dǎo)致胃癌的發(fā)生起到重要的作用，wnt3α的高表達(dá)會導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的大量積累，從而激活下游靶基因〔10〕。說明wnt3α、β-catenin在胃癌wnt信號通路激活中起雙重作用，甚至是疊加作用。蔡園園〔11〕用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，在CAG癌前病變的發(fā)展過程中，wnt3α、β-catenin 的表達(dá)量隨著疾病的發(fā)展而增加。wnt5α是非經(jīng)典的wnt信號通路，幾乎在全身各部的腫瘤中都能找到它的參與。穆標(biāo)等〔12〕用免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，從淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生到胃癌，wnt5α的表達(dá)量是一個上調(diào)的過程，表明wnt5α參加了胃癌的發(fā)生過程，是關(guān)鍵的致癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，wnt5α具有雙重作用，在不同的非經(jīng)典信號通路下，wnt5α能夠降低β-連環(huán)蛋白的積累，而在這個過程中，wnt5α的濃度并沒有變化；并且wnt5α可以通過與wnt3a競爭性與相關(guān)受體結(jié)合，抑制信號通路激活；或者wnt5α直接激活相關(guān)蛋白，促進(jìn)β-catenin的降解，從而抑制腫瘤的發(fā)生，當(dāng)wnt5α與特定受體結(jié)合時，它可以穩(wěn)定β-catenin，上調(diào)其表達(dá)，激活經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑，促使癌癥發(fā)生〔13〕。由此可見wnt5α的表達(dá)與腫瘤的類型、不同的信號通路以及與wnt5a結(jié)合的受體種類有關(guān)，并且三者之間關(guān)系復(fù)雜。