張國順 王素穎 王志源 尚華 吳貴愷 吳迪楊 王柳青 袁聚祥

(華北理工大學(xué) 1公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；2附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3唐山市傳染病院血液凈化科；4唐山市工人醫(yī)院消化科；5唐山市弘慈醫(yī)院消化科)

酒精性肝病(ALD)是一種由過度飲酒引起的疾病，包括脂肪變性、纖維化、酒精性肝炎(AH)、肝硬化及其并發(fā)癥〔1,2〕，只有30%的酒精消費(fèi)者會(huì)發(fā)展成嚴(yán)重的ALD〔3，4〕。性別、肥胖、種族、代謝綜合征、肝炎病毒感染和吸煙等被報(bào)道為與ALD發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素〔5〕。ALD的主要治療方法是控制飲酒，改善生活方式，預(yù)防原發(fā)性和繼發(fā)性肝硬化并發(fā)癥。近年來，糖皮質(zhì)激素已被用于治療ALD患者的各種臨床試驗(yàn)〔6,7〕。雖然一些ALD患者的生存率有所提高，但40%的患者對(duì)皮質(zhì)類固醇沒有反應(yīng)。AH可導(dǎo)致ALD前期大量肝細(xì)胞死亡和凋亡〔8～12〕。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)能抑制肝細(xì)胞凋亡和減輕肝損傷，因此Caspase抑制劑被認(rèn)為是治療ALD，特別是AH的分子靶點(diǎn)，但其療效尚不清楚〔13,14〕。白細(xì)胞介素(IL)-17是天然免疫系統(tǒng)中的一種趨化因子，通過刺激肝星狀細(xì)胞分泌IL-8和C-x-c基序趨化因子配體(CXCL1)，通過釋放肝實(shí)質(zhì)中的鈣網(wǎng)蛋白(RO)和蛋白酶來破壞受損的肝細(xì)胞，從而招募中性粒細(xì)胞〔15〕。靶向這些趨化因子可作為AH的治療方法。酒精引起的腸道菌群變化在AH的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，因?yàn)榫凭蓙y是一種腸道通透性，允許腸腔抗原進(jìn)入肝臟并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成和分泌〔16,17〕。益生菌可以降低內(nèi)毒素驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子水平，并改善ALD者的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平〔18,19〕。因此，通過益生菌改變腸道微生物區(qū)系可被視為治療ALD的潛在治療方法。

ALD患者基因表達(dá)的改變與ALD的發(fā)病密切相關(guān)。本研究擬分析ALD患者和健康對(duì)照者之間的差異表達(dá)基因。通過GO豐富和KEGG信號(hào)通路分析確定差異表達(dá)基因的功能。

1 材料和方法

1.1研究材料 從公開的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)門戶(GEO，2019)獲取15個(gè)ALD組織和7個(gè)正常組織的RNA表達(dá)分析數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為GSE28619。隨后原始數(shù)據(jù)下載后被用于進(jìn)一步的分析ALD中關(guān)鍵的致病基因。

1.2微陣列數(shù)據(jù)分析 基因表達(dá)譜分析主要包括原始數(shù)據(jù)的歸一化處理和差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選兩個(gè)步驟。原始基因矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理使所有樣本之間具有可比較性，RNA轉(zhuǎn)錄本的注釋用GPL570平臺(tái)注釋信息執(zhí)行〔20〕。隨后通過limmar包進(jìn)行DEGs的篩選，剪切的標(biāo)準(zhǔn)為倍數(shù)>2和P值<0.05被認(rèn)為是有意義。利用R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化圖片處理。

1.3功能富集分析 在獲取差異表達(dá)mRNA后，將所有的差異性基因分別上傳到DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) 和KOBAS (version 3.0;https://bio.tools/kobas)數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行對(duì)DEGs的生物注釋分析和KEGG細(xì)胞信號(hào)通路分析，揭示在ALD的病理進(jìn)程之中DEGs所發(fā)揮的生物學(xué)功能〔21～23〕。所有的富集結(jié)果P值<0.05被認(rèn)為是有意義。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 STRING 是一個(gè)國際性知名的蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)。將DEGs加載到數(shù)據(jù)庫后獲取蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，隨后將該網(wǎng)絡(luò)在官網(wǎng)中進(jìn)行可視化的圖片制作。

2 結(jié) 果

2.1DEGs 在各組織樣本為經(jīng)過歸一化處理之前(圖1A)各數(shù)據(jù)之間不具備可比較性，但是經(jīng)過歸一化處理之后所有數(shù)據(jù)的穩(wěn)健多陣列平均之間具有可比較性(圖1B)。保證了數(shù)據(jù)分析符合統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的基本準(zhǔn)則。隨后通過調(diào)整P值<0.05和差異倍數(shù)>2的閾值，在ALD中共獲得216個(gè)DEGs，其中上調(diào)的DEGs 108個(gè)和108個(gè)下調(diào)DEGs(圖1C)。詳盡的DEGs將其歸納到補(bǔ)充表1。這些DEGs可能在ALD的病理進(jìn)程中起著重要的調(diào)控作用。

圖1 在ALD中的差異性基因分析

表1 功能注釋分析結(jié)果

2.2功能富集分析 采用GO分析和KEGG分析揭示DEGs的功能。首先在DAVID 對(duì)216個(gè)DEGs進(jìn)行了GO的富集分析，將最有意義的前10個(gè)結(jié)果歸納到表1。隨后在KOBAS數(shù)據(jù)庫中去完成DEGs在那些細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEGs主要的富集通路在炎癥、細(xì)胞黏附、代謝相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路。見表2。

表2 細(xì)胞信號(hào)通路富集結(jié)果

2.3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫可以獲取DEGs之間的相互作用關(guān)系，將DEGs上傳到數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)中。通過調(diào)整相關(guān)參數(shù)后獲取到DEGs之間的相互作用的網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建可揭示ALD病理進(jìn)展中起著最為重要的調(diào)控作用的DEGs(圖2)。因此，處于網(wǎng)絡(luò)中核心位置的基因可能是ALD中的核心致病基因。

圖2 ALD病理進(jìn)程中的DEGs之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

雖然一些治療方法已被應(yīng)用，如一般的管理，抗TNF治療，抗氧化劑，肝移植，益生菌，趨化因子等，ALD的診斷和治療通常是在更高的并發(fā)癥和病死率的后期進(jìn)行的〔24～29〕。應(yīng)鼓勵(lì)早期準(zhǔn)確診斷和制定有效的治療目標(biāo)〔30〕。本研究分析了15例ALD患者和7例健康對(duì)照者的表達(dá)譜，共鑒定出216個(gè)DEGs。GO富集分析表明，這些差異表達(dá)基因主要屬于兩個(gè)功能群，即血管生成、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。

肝硬化是慢性肝病的終末期結(jié)局，伴隨著肝臟的進(jìn)行性纖維化，最終導(dǎo)致結(jié)節(jié)再生和功能喪失〔31,32〕。30%的肝硬化患者會(huì)發(fā)展為肝細(xì)胞癌(HCC)，并且HCC的風(fēng)險(xiǎn)與肝纖維化的發(fā)展同步增加。血管生成是支持腫瘤生長和直徑超過1～2 mm的擴(kuò)張的必要過程，血管生成可在腫瘤形成的早期階段被誘導(dǎo)〔33,34〕。本研究中發(fā)現(xiàn)的DEGs屬于血管生成的生物學(xué)過程。除了血管生成外，許多DEGs還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)，表明這些基因與ALD的進(jìn)展密切相關(guān)，靶向這些基因可能有效地干擾嚴(yán)重ALD的發(fā)生〔35〕。換句話說，這些基因的差異表達(dá)表明ALD患者具有明顯的肝纖維化、肝硬化和原發(fā)性肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

許多經(jīng)典的有機(jī)酸如膽汁酸參與肝臟脂質(zhì)代謝。膽汁酸是兩親性洗滌劑樣分子，在肝膽固醇分解代謝的末期產(chǎn)生〔36〕。膽汁酸在腸內(nèi)膽固醇、脂溶性維生素和膳食脂質(zhì)的溶解和吸收中起著重要〔37〕。此外，膽汁酸還可以促進(jìn)肝臟的膽汁流動(dòng)和膽固醇分泌，并作為調(diào)節(jié)脂質(zhì)、膽固醇和葡萄糖代謝的營養(yǎng)信號(hào)分子發(fā)揮〔38,39〕。本研究表明這些基因在脂質(zhì)、膽固醇和葡萄糖的代謝中起作用，并影響ALD的進(jìn)展。

本研究構(gòu)建了DEGs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)其程度值對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的重要基因進(jìn)行評(píng)價(jià)。重組人膜聯(lián)蛋白(ANX)A2是網(wǎng)絡(luò)中最重要的基因，是一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的鈣(Ca2+)-肌動(dòng)蛋白和磷脂結(jié)合蛋白，在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)。ANXA2參與許多生物學(xué)過程，如與胞吐、內(nèi)吞、有絲分裂信號(hào)和細(xì)胞骨架重排相關(guān)的膜運(yùn)輸。許多研究表明ANXA2參與了腫瘤的發(fā)生。有研究探討血清ANXA2在早期肝癌診斷中的臨床應(yīng)用，結(jié)果表明：ANXA2在肝癌患者和對(duì)照組之間有顯著性差異，提示血清ANXA2可作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物〔40〕。有研究表明ANXA2在大鼠體內(nèi)的過表達(dá)促進(jìn)VWF的分泌，從而減輕肝纖維化的進(jìn)展，下調(diào)ANXA2可減少VWF的分泌，ANXA2的表達(dá)與肝纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)〔41〕。脂肪鈣黏蛋白(FAT)1是另一個(gè)具有高度網(wǎng)絡(luò)性的基因，已被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、平面細(xì)胞極性和傷口愈合。FAT1在體外活化的肝星狀細(xì)胞(hscs)中高表達(dá)，下調(diào)的FAT1表達(dá)下調(diào)hscs中nf-κb活性〔42〕。這些結(jié)果表明，F(xiàn)AT1可能成為慢性肝病肝纖維化防治的新靶點(diǎn)?？傊?，所有高度表達(dá)的差異基因都與ALD的進(jìn)展密切相關(guān)，尤其是肝纖維化和肝硬化。

綜上所述，對(duì)DEGs的GO富集分析表明，它們大多參與了血管生成、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。本研究發(fā)現(xiàn)了一些新的ALD進(jìn)展相關(guān)基因，為ALD的早期診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。