田田 張志紅 崔亞云 (安徽省腫瘤醫(yī)院 呼吸腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 3003；放療科)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)主要包括肺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞未分化癌，目前臨床治療方式以手術(shù)治療為主，并輔助放化療。由于癌癥早期無(wú)顯著性病癥，影像學(xué)表現(xiàn)也不顯著，導(dǎo)致診斷、治療不及時(shí)，一旦確診大部分已步入中晚期，甚至已經(jīng)發(fā)生腦部轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后〔1〕。針對(duì)激酶靶點(diǎn)的替尼類抑制劑(吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等)已在臨床廣泛應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)患者基因突變類型，指導(dǎo)醫(yī)生個(gè)體化用藥，可有效提高晚期NSCLC的治療效率〔2〕。與NSCLC相關(guān)的常見突變基因型有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS-1)等，三種基因型的突變、融合可通過(guò)激活下游不同信號(hào)通路從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為〔3,4〕。盡管針對(duì)基因突變采用相應(yīng)的治療可有效提高治療效率，可讓患者生存獲益，但尚缺乏相應(yīng)的資料表明EGFR、ALK、ROS-1突變與NSCLC預(yù)后是否存在相關(guān)性〔3,5〕，研究旨在探討EGFR、ALK、ROS-1在肺癌患者組織的表達(dá)情況及對(duì)預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 材料與方法

1.1基本資料 2017年1月至2018年9月收治的80例老年非小細(xì)胞肺癌患者，根據(jù)1年隨訪預(yù)后情況分為死亡組(28例)、存活組(52例)。納入標(biāo)準(zhǔn)〔6〕：①經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)檢測(cè)確診為肺癌，首診無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②依從研究方案，病例資料完整；排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他原發(fā)性惡性腫瘤或者腫瘤轉(zhuǎn)移者；②合并心、腎、肝等重要臟器功能障礙，腦血管疾病者?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺狙芯揩@得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2臨床資料收集 收集入組患者的臨床資料，包括性別、年齡等一般資料及病理類型、臨床分期等病理資料及隨訪1年患者的生存、死亡情況。

1.3EGFR、ALK、ROS-1基因檢測(cè) 采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)檢測(cè)EGFR基因，首先收集肺癌組織標(biāo)本并進(jìn)行石蠟切片，切片厚度6～8 μm，數(shù)量≥10張，然后經(jīng)二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇漂洗、風(fēng)干，并刮取裝入1.5 ml EP管中，隨后按照DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN)操作說(shuō)明提取DNA，純度(A260/A280比值)在1.8～2.2范圍內(nèi)則表明操作合格。隨后將DNA稀釋至2 ng/μl，于42.3 μl DNA模板中加入2.7 μl Taq酶液，混勻后分裝到含有反應(yīng)液的8聯(lián)管中，5 μl/管，短暫離心后用熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI7500)進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)條件如下：先在95℃條件下預(yù)變性5 min，接著95℃×25 s、64℃×20 s,72℃×20 s，15個(gè)循環(huán)，93℃×25 s、60℃×35 s、72℃×20 s，31個(gè)循環(huán)，60℃收集FAM和VIC信號(hào)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析即可。

采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)ALK、ROS-1基因，具體操作如下：石蠟切片(厚度4 μm)后60℃烤片2 h，隨后二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇漂洗、風(fēng)干，并將切片浸入至93℃的超純水中溫孵30 min，取出切片后用超純水清洗，置入酶消化液中(10～20 min)進(jìn)行消化處理，取出后超純水浸洗終止消化，風(fēng)干切片并加入探針，蓋上蓋玻片并外封，接著放入雜交儀中變性80℃×5 min，雜交37℃×16 h。待雜交完成后清洗切片并置入檸檬酸鈉緩沖液(SSC)溶液中3 min，去除蓋玻片，再次于73℃ SSC溶液中溫孵3 min，取出風(fēng)干加入10 μl 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)，蓋好蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。細(xì)胞陰性判定：產(chǎn)生1個(gè)橙色、綠色融合信號(hào)；細(xì)胞陽(yáng)性判定：?jiǎn)为?dú)存在的1個(gè)橙色熒光信號(hào)，或者1組橙色和綠色熒光信號(hào)，其間隔距離超過(guò)兩個(gè)信號(hào)半徑大小,至少計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞中，以15%為臨界值，若超過(guò)15%的細(xì)胞表現(xiàn)為陽(yáng)性則判斷為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier 法、Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與臨床病理特征的關(guān)系 ALK陽(yáng)性患者8例(10.00%)，ROS-1陽(yáng)性患者2例(2.50%)，EGFR陽(yáng)性患者35例(43.75%)。肺癌組織EGFR、ALK均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、分化程度、預(yù)后相關(guān)(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.2肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與預(yù)后關(guān)系 80例老年NSCLC患者，通過(guò)Kaplan-Meier 生存分析，整體無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)中位時(shí)間為7.44個(gè)月。通過(guò)Log-rank 檢驗(yàn)，肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1呈現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，患者PFS顯著長(zhǎng)于陰性(P<0.05)。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示ALK、ROS1及EGFR突變與患者的PFS相關(guān)(均P<0.001)，見表2。

表2 肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與預(yù)后關(guān)系

2.3肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與NSCLC患者獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素的相關(guān)分析 經(jīng)對(duì)患者的癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變及腫瘤分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行PFS的Cox回歸多因素分析，結(jié)果顯示EGFR、ALK、ROS-1突變及腫瘤分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為影響NSCLS患者PFS的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 患者生存影響多因素分析結(jié)果

3 討 論

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示NSCLC患者5年生存率僅為15%，因此診治過(guò)程中尋找可準(zhǔn)確評(píng)估非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為(如突變耐藥性、轉(zhuǎn)移性等)及準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)于指導(dǎo)醫(yī)師針對(duì)性的治療方案至關(guān)重要，從而提高診治效率，降低死亡風(fēng)險(xiǎn)〔7，8〕。目前評(píng)估NSCLC預(yù)后的指標(biāo)眾多，主要分為血清學(xué)指標(biāo)(癌胚抗原、癌抗原125細(xì)胞角質(zhì)素片段抗原、神經(jīng)元異性烯醇化酶等)〔9〕、組織學(xué)指標(biāo)(EGFR、ALK、ROS-1、VEGF等)〔4〕，其中血清標(biāo)志物容易受到多種因素的干擾(吸煙、飲食、感染、生理狀態(tài)等)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性，組織病理學(xué)檢測(cè)是眾多疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可鑒別正常和病理組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，組織學(xué)診斷價(jià)值較高，且EGFR、ALK、ROS-1均可在肺癌組織中高表達(dá)，可有效反映患者癌基因突變類型，從而指導(dǎo)靶向治療方案的選擇。

EGFR作為受體酪氨酸激酶家族成員，與NSCLC、卵巢癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等)已廣泛用于NSCLC的一線、二線靶向治療〔4〕，關(guān)于EGFR的表達(dá)情況與患者預(yù)后相關(guān)性尚存爭(zhēng)議，而此次研究發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)水平與預(yù)后存在相關(guān)性，其陽(yáng)性患者死亡率顯著低于陰性患者，PFS顯著長(zhǎng)于陰性患者。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性患者具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，分析認(rèn)為EGFR的過(guò)表達(dá)可大量激活下游ras/rsf/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸肌醇激酶信號(hào)通路，從而調(diào)控有絲分裂信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等生物學(xué)行為，同時(shí)還能促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，故而增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。盡管EGFR突變與ALK融合基因在NSCLC患者中有很多共同之處，但兩者相互排斥，合并突變發(fā)生率極低，使得ALK融合基因陽(yáng)性可成為NSCLC患者一種獨(dú)立亞型〔10〕。NSCLC中ALK基因常與EML4基因融合，從而促進(jìn)ALK基因持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而激活下游磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者ALK突變陽(yáng)性率與病理特征(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、分化程度)具有相關(guān)性，且陽(yáng)性患者具有更高死亡率。Zhao等〔12〕通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)ALK融合基因在Ⅲ期、Ⅳ期的NSCLC患者中的檢出率明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，高瓊瓊等〔3〕報(bào)道顯示NSCLC患者ALK融合基因的陽(yáng)性率可達(dá)9.0%，而早期患者陽(yáng)性率在2.4%～8.6%，與本研究結(jié)果一致，即在晚期患者中具有更高的陽(yáng)性率。ALK陽(yáng)性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯高于陰性患者，表明ALK患者具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)，也進(jìn)一步說(shuō)明晚期NSCLC患者陽(yáng)性率高于陰性率。研究發(fā)現(xiàn)ALK陽(yáng)性患者的總生存期為97.7個(gè)月，明顯高于陰性患者(78.9個(gè)月)〔13〕，表明陽(yáng)性患者具有更優(yōu)的預(yù)后效果，與本研究一致，分析認(rèn)為患者接受了替尼類藥物的靶向治療，可有效阻滯ALK下游信號(hào)通路，從而進(jìn)一步阻滯腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲，故而提高治療效果。

ROS-1作為胰島素受體家族中的一種酪氨酸激酶，在NSCLC中可與SLC34A、CD74融合，并激活下游PI3K/AKT、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)導(dǎo)激活子(JAK/STAT)、RAS/MAPK等信號(hào)通路，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)ROS-1基因突變與病理類型、臨床分期等有關(guān)，與楊三虎等〔14〕報(bào)道一致。ALK和ROS-1在激酶結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列、三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)上均具有同源性，分別為49%、77%，因此目前所有ALK抑制劑均可有效控制ROS-1融合患者(艾樂(lè)替尼除外)〔2〕。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)同一患者中ROS-1融合基因突變、EGFR突變共存率極低，各種基因型突變的共存情況下選中何種激酶抑制劑是臨床尚需進(jìn)一步論證的方向〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR、ALK、ROS-1突變均與患者的預(yù)后具有相關(guān)性，陽(yáng)性患者采用標(biāo)準(zhǔn)化療相對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的靶向療法具有更低得生存率，為靶向療法及個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。