柳雙桂， 張慧燕， 王震華

［華中科技大學(xué)協(xié)和江南醫(yī)院（武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院）康復(fù)醫(yī)學(xué)科，湖北武漢430200］

缺血性卒中是卒中的主要亞型（約87%），是成人死亡和長期殘疾的主要原因之一［1］。腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）是腦血管系統(tǒng)的重要組成部分，在缺血性卒中的病理過程中起著重要作用［2］。內(nèi)皮細胞的主要功能之一是在生理條件下維持血腦屏障的完整性［3］。缺血性卒中后，血腦屏障被破壞，導(dǎo)致出血性轉(zhuǎn)化和腦組織梗死。因此，BMECs成為治療缺血性卒中的新靶點。發(fā)育及DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白1（protein regu?lated in development and DNA damage response 1，REDD1）受多種應(yīng)激刺激誘導(dǎo)，包括氧糖剝奪（oxy?gen-glucose deprivation，OGD）和缺氧［4］，在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中具有多種生物學(xué)功能［5］。有證據(jù)表明REDD1的表達在OGD作用下上調(diào)［6］。最近，已有研究證明REDD1缺失減少了活性氧（reactive oxy?gen species，ROS）的產(chǎn)生和促炎細胞因子的表達［7］。此外，REDD1是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mamma?lian target of rapamycin，mTOR）的內(nèi)源性抑制劑，可調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激反應(yīng)［4］。然而，REDD1激活在腦梗死后血管生成中的作用尚未見深入研究。因此，本研究以O(shè)GD處理人BMECs（human BMECs，HBMECs）模擬缺血性腦卒中的細胞損傷，分析REDD1的血管保護作用和促血管生成機制，旨在尋找治療缺血性腦卒中的潛在治療靶點。

材料和方法

1 實驗材料

HBMECs購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。2′，7′-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體3000、Trizol試劑和Alexa Fluor 594 Phalloidin（Invitrogen）；第1鏈cDNA合成試劑盒（Roche）；SYBRGreen PCRMaster Mix試劑盒（Applied Biosystems）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）、裂解緩沖液+蛋白酶抑制劑混合物和小鼠抗BrdU抗體（Sig?ma-Aldrich）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；PVDF膜和兔抗神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）抗體（EMD Millipore）；兔抗REDD1和GAPDH抗體（Santa Cruz）；CCK-8試劑盒（Boster）；與過氧化物酶結(jié)合的Ⅱ抗、兔抗vWF抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam）；針對REDD1的小干擾RNA［REDD1small interfering RNA（siRNA），si-REDD1］及其陰性對照（negative control siRNA，si-NC）均由GenePhar?ma設(shè)計合成。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HBMECs在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了模擬體外缺血樣條件，HBMECs在不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃的N（295%）和CO（25%）濕空氣中孵育2 h。隨后，用正常培養(yǎng)基替換不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，并在正常條件下培養(yǎng)細胞。對照組在正常條件下在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在模擬OGD前，將HB?MECs以每孔5×104個的密度接種于24孔板。然后用脂質(zhì)體3000將100 nmol/L si-REDD1和si-NC分別轉(zhuǎn)染入細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞并進行OGD處理。

2.2 RT-qPCR分析 使用Trizol試劑從HBMECs中提取總RNA。使用SmartSpec Plus分光光度計（Bio-Rad Laboratories）評估RNA純度。使用第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green PCR Mas?ter Mix試劑盒和ABI 7500實時PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）進行實時定量PCR。mRNA表達值根據(jù)2?ΔΔCt法計算，GAPDH為內(nèi)參照。REDD1的正向引物序列為5′-TGCTTAGGGTGAAAAATACCTT-3′，反向引物序列為5′-TGATTTGTATGACCTGAGAAA-3′；GAPDH的正向引物序列為5′-CACCATTGGAT?GAGGGTTC-3′，反 向 引 物 序 列 為5′-TGCTG?GAAGGGATGAGGG-3′。

2.3 Western blot分析 使用裂解緩沖液+蛋白酶抑制劑混合物提取蛋白質(zhì)，并采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測量蛋白濃度。將每個樣品中等量的蛋白分離到10%SDS-PAGE上，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂奶粉緩沖液封閉1 h，并在4℃下與抗REDD1抗體（1∶500）和抗GAPDH抗體（1∶1 000）孵育過夜。然后，在室溫下與過氧化物酶結(jié)合的Ⅱ抗孵育1 h。使用增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）觀察蛋白條帶。用Image-Pro Plus 6.0軟件定量測定蛋白表達。以GAPDH作為內(nèi)參照。

2.4 CCK-8法分析細胞活力 將細胞懸浮液（100μL）接種到96孔板中。轉(zhuǎn)染和/或OGD處理后，將10μL CCK-8試劑添加到每個孔中并孵育2 h。最后，通過微孔板讀取器（Bio-Rad）檢測450 nm處的吸光度（A）值。

2.5 細胞內(nèi)ROS生成的檢測 使用DCFH-DA染色測量細胞內(nèi)ROS的生成。將細胞懸浮液（100μL）接種到96孔板中。轉(zhuǎn)染和/或OGD處理后，加入10μmol/L CM-H2DCF-DA在37℃黑暗中孵育30 min。用PBS洗滌細胞3次后，通過熒光顯微鏡拍攝圖像。使用ImageJ軟件對每組隨機選取的3個顯微視野的相對細胞熒光強度進行定量分析。

2.6 肌動蛋白染色 細胞以每孔5×105個的密度接種在12孔板上，當(dāng)細胞融合率達到70%～80%時，用4%多聚甲醛固定，加入0.1%Triton X-100透皮3 min，5%牛血清白蛋白封閉30 min，細胞與Alexa Flour 594 Phalloidin在37℃中避光孵育1 h。隨后，用PBS洗滌3次后，用DAPI染色3 min，并使用熒光顯微鏡獲得圖像。

2.7 大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlu?sion，MCAO）模型的建立和分組 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（260~300 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證編號為SCXK（京）2018-0002，在手術(shù)前可以自由獲得水和食物。大鼠隨機分為假手術(shù)（sham）組、MCAO組、MCAO+si-NC組和MCAO+si-REDD1組。將所有siRNA溶解于無RNase的水中，終濃度為2 g/L，振蕩并反復(fù)離心，然后注入MCAO造模大鼠大腦受損區(qū)域（12μL），坐標(biāo)如下：前后0.9 mm、左右1.9 mm和背側(cè)3.5 mm，并保留10 min。24 h后建立MCAO模型。MCAO模型建立方法如下：SD大鼠用3%異氟醚麻醉并置于立體定向框架中。在顳肌與頂骨交界處作縱切口。然后用刀柄將顳肌與顳板分離，暴露顳窩，用小電鉆在顳窩上鉆一個小孔，暴露大腦中動脈后，在左側(cè)大腦中動脈內(nèi)放置一根尖端呈圓形的尼龍絲（北京西濃科技有限公司）60 min，然后緩慢取出尼龍絲，恢復(fù)缺血動脈的血流，開始再灌注。用PeriFlux 5000激光多普勒儀（Perimed AB）在缺血前、MCAO期間和再灌注期間檢測腦血流。假手術(shù)組大鼠除不進行閉塞外，其余步驟同MCAO大鼠。手術(shù)過程中使用加熱燈將大鼠直腸溫度維持在37℃左右。在MCAO造模后3、7和14 d，采用改良神經(jīng)功能缺損評分（modi?fied neurological severity score，mNSS）對大鼠進行神經(jīng)功能評分。

2.8 腦梗死體積的測量 MCAO造模后14 d處死大鼠。大鼠腦灌流生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛。取出整個大腦，在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜，然后用30%蔗糖脫水。將腦組織切成20μm厚的冰凍切片。將切片放入2%的TTC溶液中放置15 min，無光照。用4%多聚甲醛固定24 h，用ImageJ軟件定量分析。梗死（白色部分）體積以占整個腦區(qū)體積的百分比表示。

2.9 免疫熒光染色 采用免疫熒光雙染法檢測BrdU/NeuN和BrdU/vWF陽性細胞。將20μm厚的冰凍切片用50%甲酰胺/2×生理鹽水枸櫞酸鈉緩沖液在65℃處理2 h，用37℃、2 mol/L鹽酸孵育30 min，再用0.1 mol/L硼酸（pH 8.5）中和10 min，再用5%山羊血清處理1 h，并與小鼠抗BrdU抗體（1∶200）、兔抗NeuN抗體（1∶500）和兔抗vWF抗體（1∶200）在4℃孵育過夜，隨后與Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶100）在37℃下孵育1 h。使用DMIL倒置熒光顯微鏡（Leica）獲取圖像。從每個樣本中隨機選擇3個區(qū)域進行陽性細胞計數(shù)分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism 7.0軟件進行。所有實驗均獨立重復(fù)至少3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。統(tǒng)計推斷采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OGD處理對HBMECs中REDD1表達的影響

在體外缺血性卒中模型中，OGD處理后6、12和24 h的HBMECs中REDD1的mRNA表達均上調(diào)（P<0.05），見圖1A。Western blot分析證實REDD1在蛋白水平上亦顯著上調(diào)（P<0.05），見圖1B。這提示REDD1可能在缺血性卒中中起重要作用。

2 敲減REDD1表達減輕OGD對HBMECs的損傷

為了確定REDD1在OGD誘導(dǎo)的HBMECs損傷中的作用，本研究用si-NC和si-REDD1分別轉(zhuǎn)染細胞，然后用OGD處理細胞。結(jié)果顯示，特異性si-REDD1可有效下調(diào)OGD處理的HBMECs中REDD1蛋白的表達，見圖2A。進一步的細胞功能評價顯示，OGD處理誘導(dǎo)細胞骨架紊亂，應(yīng)力纖維減少，足細胞骨架皺縮成多邊形，且細胞活力降低（P<0.05）；而REDD1沉默使細胞骨架趨于正常，并且提高了細胞活力，見圖2B、C。為了研究REDD1在調(diào)節(jié)OGD介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用，我們使用DCFH-DA染色測定了細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。如圖2D所示，將細胞暴露于OGD可顯著增強ROS的生成，而敲減REDD1阻止了細胞內(nèi)ROS生成的增加（P<0.05）。

Figure 1.The effect of OGD treatment on the expression of REDD1 in HBMECs.A：the mRNA expression of REDD1 was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to detect the protein level of REDD1.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖1 OGD處理對HBMECs中REDD1表達的影響

Figure 2.Silencing of REDD1 reduced the damage of HBMECs with OGDtreatment.A：Western blot was used to detect the efficien?cy of REDD1 knock-down；B：the cytoskeleton was detected by F-actin staining；C：CCK-8 assay was used to measure the cell viability；D：the intracellular ROScontent was analyzed by DCFH-DA staining.The scale bar=5μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD+si-NCgroup.圖2敲減REDD1表達減輕OGD對HBMECs的損傷

3 敲減REDD1表達促進MCAO大鼠神經(jīng)功能 恢復(fù)

MCAO大鼠神經(jīng)功能損害嚴(yán)重，在MCAO術(shù)后第3、7和14天的mNSS均顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），且在MCAO后第14天時TTC染色顯示大腦半球梗死體積顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），表明MCAO模型成功建立；此外，Western blot分析顯示，MCAO大鼠腦梗死組織中REDD1蛋白表達顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），通過si-REDD1降低MCAO大鼠腦組織中REDD1蛋白表達（P<0.05）后，大鼠在3、7和14 d的mNSS均顯著低于MCAO組（P<0.05），且大鼠的梗死體積顯著減少（P<0.05），見圖3。

Figure 3.REDD1 silencing promoted the recovery of neural function in MCAO rats.A：the modified neurological severity score（mNSS）of rats in each group at different time points after MCAO（n=3）；B：the representative images of TTCstaining and quantitative analysis of cerebral infarction volume in each group（n=5）；C：Western blot was used to detect the protein ex?pression of REDD1 in rat brain tissues（n=3）.Mean±SD.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs MCAO+si-NCgroup.圖3敲減REDD1的表達促進MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)

4 敲減REDD1表達促進MCAO大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成

采用BrdU/NeuN和BrdU/vWF免疫熒光染色，觀察REDD1敲減后神經(jīng)發(fā)生和血管生成情況。與MCAO組相比，REDD1沉默組BrdU+/NeuN+細胞數(shù)和BrdU+/vWF+細胞數(shù)均顯著增加（P<0.05），見圖4。這一結(jié)果表明，敲減REDD1表達促進了MCAO大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成。

討 論

發(fā)現(xiàn)有希望的靶點和有效的治療方法是缺血性腦卒中研究的主要目標(biāo)之一。血管生成對于改善缺血性卒中的預(yù)后非常重要［8］。在缺血性卒中患者中，新血管的數(shù)量與延長生存期相關(guān)［9］。BMECs功能障礙是影響血管生成的主要原因［10］。OGD誘導(dǎo)BMECs損傷的分子機制復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)，在OGD處理的HBMECs中，REDD1的表達明顯升高，且細胞存在明顯的骨架紊亂、應(yīng)力纖維減少和細胞活力降低。REDD1是一種高度保守的應(yīng)激相關(guān)蛋白，其表達可由缺氧/缺血和DNA損傷等多種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)［11］。先前的研究發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜下腔出血后患者腦脊液中REDD1水平明顯升高，REDD1水平與Hunt-Hess分級呈正相關(guān)，而正常腦脊液中幾乎不存在REDD1表達，表明REDD1與蛛網(wǎng)膜下腔出血所致神經(jīng)元損傷有密切關(guān)系［12］。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，敲減REDD1的表達對OGD誘導(dǎo)的HBMECs損傷有緩解作用，表明REDD1與缺血性腦卒中進展有關(guān)。這些結(jié)果證明REDD1的表達增加參與介導(dǎo)了OGD誘導(dǎo)的HBMECs損傷。

Figure 4.REDD1 silencing promoted neurogenesis and angiogenesis in MCAO rats.A：BrdU（red）/NeuN（green）double immuno?fluorescence staining and quantitative analysis；B：BrdU（red）/vWF（green）double immunofluorescence staining and quantitative analysis.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs MCAO+si-NCgroup.圖4 敲減REDD1的表達促進MCAO大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成

氧化應(yīng)激是由氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡引起的。目前認(rèn)為，REDD1對不同神經(jīng)元的毒性作用是通過降低對氧化應(yīng)激的敏感性介導(dǎo)。REDD1/TXNIP復(fù)合表達能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，抑制ATG4B活性，激活自噬。在REDD1缺失小鼠中，ATG4B活性上調(diào)和自噬通量的增加減少了線粒體缺陷，進而減輕了氧化磷酸化損傷［13］。REDD1沉默可能通過減輕OGD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激保護HBMECs。為了了解REDD1在OGD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用，我們檢測了OGD誘導(dǎo)的HBMECs的ROS生成的情況，結(jié)果顯示敲減REDD1的表達減少了OGD誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS的生成。這些發(fā)現(xiàn)為REDD1通過激活氧化應(yīng)激促進OGD誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的主要機制提供了有力的證據(jù)。總的來說，我們的結(jié)果證實了REDD1在HBMECs中的重要作用，從而可能在缺血性卒中發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

為了進一步明確REDD1在缺血性卒中治療中的作用，本研究進一步考察了敲減REDD1的表達對MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。結(jié)果顯示，REDD1沉默可改善缺血后14 d MCAO大鼠的神經(jīng)功能評分并減輕腦梗死體積。腦卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生和血管生成促進腦修復(fù)和功能恢復(fù)［14-15］。鑒于敲減REDD1的表達可減輕OGD誘導(dǎo)的HBMECs細胞骨架損傷，并增強其功能。本研究進一步通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，敲減REDD1的表達增加了MCAO大鼠BrdU+/NeuN+和BrdU+/vWF+的細胞數(shù)量，提示REDD1在調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后的神經(jīng)發(fā)生和血管生成中發(fā)揮重要作用。

總的來說，敲減REDD1表達降低了OGD誘導(dǎo)的HBMECs損傷和氧化應(yīng)激，并有助于增強MCAO大鼠神經(jīng)發(fā)生和血管生成，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，REDD1可能是缺血性卒中后腦修復(fù)和功能恢復(fù)的潛在治療靶點。